原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)的操作步驟及核心區(qū)別對比！
小楊 / 2025-12-26 09:51:23
百歐博偉生物：原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)的操作步驟核心差異在于原代細胞需先從組織中解離純化，而傳代細胞直接對貼壁/懸浮細胞進行消化轉(zhuǎn)移，二者均需嚴格遵循無菌操作（超凈臺、無菌試劑、手套口罩等），具體步驟如下：
一、原代細胞培養(yǎng)操作步驟（以貼壁型組織為例，如大鼠支氣管上皮細胞、小鼠肝臟細胞）
原代培養(yǎng)核心：組織解離→細胞純化→接種培養(yǎng)→初期觀察，需避免組織消化過度或污染。
1、實驗準備
試劑：含雙抗的 PBS 緩沖液、胰蛋白酶（0.25% Trypsin-EDTA）、膠原酶（部分組織需，如上皮組織用膠原酶 Ⅰ/Ⅳ）、原代細胞專用培養(yǎng)基（如支氣管上皮細胞用 BEBM 培養(yǎng)基 + 生長因子添加劑）、胎牛血清（FBS，中和胰酶用）。
器材：無菌培養(yǎng)皿、離心管、移液管、眼科剪、眼科鑷、篩網(wǎng)（100 目 / 200 目，過濾組織碎片）、細胞培養(yǎng)瓶/皿（提前用鼠尾膠原 Ⅰ 包被，增強貼壁性）。
樣本：新鮮活體組織（如大鼠支氣管，取材后立即放入含雙抗的 PBS 中，4℃保存，1h 內(nèi)處理）。
2、組織解離與細胞分離
（1）組織清洗與剪碎：
將組織塊放入無菌培養(yǎng)皿，用 PBS 沖洗 3 次（每次加入 5mL PBS，輕輕晃動，棄去上清），去除血污、脂肪等雜質(zhì)。
用眼科剪將組織剪碎至 1mm³ 左右的小塊（越碎越易消化），期間可滴加少量 PBS 保持濕潤，避免組織干燥。
（2）酶解消化（關(guān)鍵步驟，避免過度消化）：
貼壁上皮細胞/結(jié)締組織：加入適量膠原酶 Ⅰ（終濃度 0.1-0.3mg/mL）+ 0.25% 胰蛋白酶（體積比 1:1），37℃水浴消化 30-60min，每 10min 輕輕搖晃培養(yǎng)皿 1 次，觀察組織塊是否分散。
肝臟/腎臟等實質(zhì)組織：僅用 0.25% 胰蛋白酶消化 15-30min，或用胰酶 + EDTA（0.02%）混合液，提高消化效率。
終止消化：當組織塊大部分分散為單個細胞或小細胞團時，加入 2-3mL 含 10% FBS 的培養(yǎng)基，輕輕吹打，中和胰酶活性。
（3）過濾與離心純化：
將消化后的細胞懸液通過 100 目篩網(wǎng)過濾至離心管中，去除未消化的組織碎片，用 PBS 沖洗篩網(wǎng) 2 次，收集全部細胞。
800-1000rpm 離心 5min，棄去上清（含酶液和雜質(zhì)），加入 5mL PBS 重懸細胞，再次離心 5min，洗滌 2 次。
3、細胞接種與培養(yǎng)
用原代細胞專用培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度（如支氣管上皮細胞接種濃度為 1×10?-5×10? cells/cm²）。
將細胞懸液均勻接種到預包被的培養(yǎng)瓶/皿中，輕輕搖晃使細胞分布均勻。
放入 37℃、5% CO?、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 內(nèi)不移動培養(yǎng)瓶（避免影響細胞貼壁）。
4、初期培養(yǎng)與換液
培養(yǎng) 12-24h 后，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況（原代細胞貼壁較慢，如支氣管上皮細胞 12-18h 開始貼壁）。
48h 后首次換液，用 PBS 輕輕沖洗細胞表面 1 次，去除未貼壁的死細胞和雜質(zhì)，加入新鮮培養(yǎng)基，后續(xù)每 2-3 天換液 1 次，直至細胞匯合至 70%-80%（原代細胞一般不超過 2 代，匯合后可傳代或凍存）。
二、傳代細胞培養(yǎng)操作步驟（以貼壁型傳代細胞系為例）
傳代培養(yǎng)核心：消化貼壁細胞→離心重懸→分瓶接種，操作更簡便，重點控制消化時間。
1、實驗準備
試劑：含雙抗的 PBS 緩沖液、0.25% Trypsin-EDTA、傳代細胞培養(yǎng)基（如 DMEM+10% FBS）。
器材：無菌培養(yǎng)瓶/皿、離心管、移液管、倒置顯微鏡。
細胞：處于對數(shù)生長期的貼壁細胞，匯合度達 70%-90%（此時細胞增殖活躍，傳代后存活率高）。
2、傳代操作步驟
（1）細胞清洗：
吸棄培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，加入 3-5mL PBS（根據(jù)培養(yǎng)瓶大小調(diào)整），輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，沖洗細胞表面殘留的血清（血清會抑制胰酶活性），棄去 PBS，重復沖洗 1 次。
（2）胰酶消化：
加入適量 0.25% Trypsin-EDTA（覆蓋細胞單層即可，如 T25 培養(yǎng)瓶加 1mL），放入 37℃培養(yǎng)箱中消化 1-3min（傳代細胞消化速度快，避免消化過度）。
顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)：當細胞從貼壁狀態(tài)變?yōu)閳A形、間隙增大，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)壁，細胞能快速脫落時，立即終止消化。
（3）終止消化與離心：
加入 2-3mL 含 10% FBS 的培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞（從培養(yǎng)瓶底部邊緣開始，避免用力過猛損傷細胞），使細胞完全分散為單個細胞懸液。
將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，800-1000rpm 離心 5min，棄去上清（含胰酶）。
（4）重懸與分瓶：
加入新鮮培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞沉淀，使細胞均勻重懸，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度（傳代細胞接種濃度一般為 1×10?-5×10? cells/cm²，根據(jù)細胞增殖速度調(diào)整）。
將重懸后的細胞懸液按比例分接種到新的培養(yǎng)瓶中（如 1:2 或 1:3 傳代，即 1 瓶細胞分 2-3 瓶），補充培養(yǎng)基至適宜體積（T25 培養(yǎng)瓶加 5mL，T75 加 15mL），輕輕搖晃使細胞分布均勻。
（5）培養(yǎng)與觀察：
放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代細胞貼壁快（一般 2-6h 貼壁），24h 后觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，后續(xù)每 1-2 天換液 1 次，待細胞匯合度達 70%-90% 時可再次傳代或凍存。
3、懸浮型傳代細胞操作簡化
無需胰酶消化：當細胞密度達到 1×10?-2×10? cells/mL 時，直接取細胞懸液，按 1:2-1:4 比例加入新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中即可，無需離心（若細胞沉淀過多，可 800rpm 離心 5min 后重懸分瓶）。
三、核心操作差異對比表
操作環(huán)節(jié) 原代細胞培養(yǎng) 傳代細胞培養(yǎng)
前置步驟 需組織解離、酶解、過濾純化 直接使用貼壁/懸浮細胞，無組織處理步驟
消化要求 需膠原酶 + 胰酶聯(lián)合消化，時間長（30-60min），需嚴格控制避免過度 僅胰酶消化，時間短（1-3min），貼壁細胞快速脫落即終止
培養(yǎng)基 專用原代培養(yǎng)基 + 生長因子添加劑 普通培養(yǎng)基（DMEM/RPMI 1640）+ 血清，無需特殊添加劑
接種濃度 較高（1×10?-5×10? cells/cm²），保證貼壁存活率 較低（1×10?-5×10? cells/cm²），增殖快易匯合
貼壁時間 長（12-24h），部分需基質(zhì)包被 短（2-6h），無需包被（少數(shù)除外）
傳代頻率 低（僅 1-2 代），易衰老凋亡 高（可傳代數(shù)十次，永生化細胞無限傳代）
四、關(guān)鍵注意事項
無菌操作：全程在超凈臺內(nèi)進行，試劑、器材需提前滅菌，避免細菌、真菌污染（原代細胞污染后無法挽救，傳代細胞可嘗試用抗生素處理，但效果有限）。
消化控制：原代細胞消化過度會導致細胞死亡，傳代細胞消化不足則細胞不易脫落，消化時需頻繁鏡檢。
培養(yǎng)基適配：原代細胞對培養(yǎng)基要求嚴格，需使用專用培養(yǎng)基（如上皮細胞避免過高血清濃度，一般 5%-10%），傳代細胞可通用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
細胞狀態(tài)：原代細胞接種后避免頻繁移動，傳代細胞需在對數(shù)生長期傳代，避免細胞過密或過稀影響生長。
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