微生物培養(yǎng)基在儲(chǔ)存過程中，應(yīng)該如何避免微生物污染？
小楊 / 2025-12-30 10:18:27
百歐博偉生物：微生物培養(yǎng)基儲(chǔ)存過程中的微生物污染，核心來源是環(huán)境雜菌入侵（空氣、儲(chǔ)存設(shè)備）、滅菌殘留芽孢萌發(fā)、交叉污染，需通過“源頭控制 - 過程防護(hù) - 末端監(jiān)測(cè)”的全流程防控體系，結(jié)合培養(yǎng)基類型和儲(chǔ)存條件針對(duì)性優(yōu)化，具體措施如下：
一、源頭控制：從制備到分裝，切斷初始污染風(fēng)險(xiǎn)
1、確保滅菌徹底（最核心前提）
標(biāo)準(zhǔn)化滅菌參數(shù)：
常規(guī)培養(yǎng)基（如 LB、營(yíng)養(yǎng)瓊脂）：高壓蒸汽滅菌 121℃、15-30 分鐘（體積＞500mL 時(shí)延長(zhǎng)至 30-40 分鐘，確保內(nèi)部溫度達(dá)標(biāo)）；
熱敏成分（血清、抗生素、維生素）：?jiǎn)为?dú)用 0.22μm 濾膜過濾滅菌，避免高壓破壞，且過濾設(shè)備需提前滅菌（紫外 + 75% 酒精消毒）；
固體培養(yǎng)基（平板）：滅菌后趁熱分裝，避免冷卻后二次加熱（易導(dǎo)致瓊脂降解、污染風(fēng)險(xiǎn)升高）。
滅菌效果驗(yàn)證：
每次滅菌時(shí)放置生物指示劑（如
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子條），滅菌后培養(yǎng) 48 小時(shí)，若指示劑無菌生長(zhǎng)，說明滅菌合格；
液體培養(yǎng)基滅菌后觀察澄清度，固體培養(yǎng)基觀察凝固狀態(tài)，若出現(xiàn)渾濁、沉淀或異常菌落，直接廢棄。
2、分裝與密封操作無菌化
分裝環(huán)境：在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作前用紫外燈消毒 30 分鐘，臺(tái)面用 75% 酒精擦拭，操作人員戴無菌手套、口罩，避免氣溶膠污染；
容器選擇與處理：
選用無菌、無破損的培養(yǎng)皿/試劑瓶（一次性耗材需檢查包裝完整性，重復(fù)使用的玻璃容器需經(jīng) 121℃高壓滅菌 30 分鐘，或 160℃干熱滅菌 2 小時(shí)）；
容器封口：液體培養(yǎng)基用螺旋蓋試劑瓶（擰緊后纏繞膜密封），固體平板倒置后貼封口膜（留 1-2 個(gè)微小透氣孔，避免冷凝水過多導(dǎo)致霉菌滋生）；
避免分裝污染：分裝時(shí)瓶口靠近酒精燈火焰，液體培養(yǎng)基避免濺到瓶口外側(cè)（殘留培養(yǎng)基易滋生雜菌），平板分裝后立即蓋好皿蓋，待凝固后倒置儲(chǔ)存。
二、過程防護(hù)：優(yōu)化儲(chǔ)存環(huán)境，阻斷雜菌入侵路徑
1、規(guī)范儲(chǔ)存環(huán)境條件
儲(chǔ)存設(shè)備選擇與清潔：
優(yōu)先使用專用冷藏柜（4℃）儲(chǔ)存，避免與食品、試劑、污染樣品混放；
每月清潔儲(chǔ)存設(shè)備：用 75% 酒精擦拭內(nèi)壁（重點(diǎn)清理角落殘留的培養(yǎng)基、霉菌），必要時(shí)用含氯消毒劑浸泡托盤，沖洗后晾干，紫外線消毒 30 分鐘；
避免儲(chǔ)存設(shè)備溫度波動(dòng)（如頻繁開關(guān)門、靠近熱源），溫度波動(dòng)易導(dǎo)致培養(yǎng)基冷凝水產(chǎn)生，增加污染風(fēng)險(xiǎn)。
控制環(huán)境濕度與光照：
儲(chǔ)存環(huán)境濕度控制在 40%-60%（濕度過高易滋生霉菌，過低導(dǎo)致培養(yǎng)基干裂），可放置硅膠干燥劑（定期更換）；
避免光照（尤其是紫外線、強(qiáng)光），霉菌孢子在光照下易萌發(fā)，且會(huì)加速培養(yǎng)基成分降解，可使用棕色試劑瓶或黑色塑料袋包裹培養(yǎng)基。
2、分類儲(chǔ)存，避免交叉污染
按污染風(fēng)險(xiǎn)分層存放：
未接種的無菌培養(yǎng)基（高潔凈度）放在冷藏柜上層，已接種的樣品、污染風(fēng)險(xiǎn)高的培養(yǎng)基（如含菌廢液）放在下層，避免滴落污染；
選擇性培養(yǎng)基（含抗生素）與普通培養(yǎng)基分開儲(chǔ)存，抗生素易降解，且可能對(duì)其他培養(yǎng)基造成潛在污染；
按培養(yǎng)基類型分開存放：
液體培養(yǎng)基與固體平板分開（液體培養(yǎng)基滲漏易污染平板），厭氧培養(yǎng)基（含還原劑）密封后單獨(dú)放置（避免接觸空氣導(dǎo)致還原劑失效，同時(shí)減少與有氧環(huán)境雜菌的接觸）；
不同批次、不同配方的培養(yǎng)基貼清晰標(biāo)簽（名稱、制備日期、有效期），避免混淆和交叉污染。
3、控制儲(chǔ)存時(shí)間，避免芽孢萌發(fā)
按培養(yǎng)基類型設(shè)定有效期：
液體培養(yǎng)基：4℃密封儲(chǔ)存 1-2 周，超過則易滋生雜菌（如
芽孢桿菌）；需長(zhǎng)期儲(chǔ)存的可分裝為 10-50mL 小體積，-20℃冷凍（6 個(gè)月內(nèi)使用），避免反復(fù)凍融；
固體平板：4℃密封儲(chǔ)存 1-3 個(gè)月，超過則瓊脂老化、污染風(fēng)險(xiǎn)升高；
選擇性培養(yǎng)基（含抗生素）：現(xiàn)配現(xiàn)用，最長(zhǎng)不超過 1 周（抗生素降解后無法抑制雜菌）；
避免反復(fù)凍融：冷凍儲(chǔ)存的培養(yǎng)基（如血清培養(yǎng)基）分裝為小體積，一次使用一瓶，解凍時(shí) 4℃緩慢解凍（如過夜），解凍后 4℃儲(chǔ)存不超過 3 天，嚴(yán)禁反復(fù)凍融（易導(dǎo)致成分變性、污染風(fēng)險(xiǎn)增加）。
三、末端監(jiān)測(cè)：定期檢查，及時(shí)剔除污染培養(yǎng)基
1、儲(chǔ)存期間定期巡檢
外觀檢查：每周查看一次培養(yǎng)基，重點(diǎn)觀察：
液體培養(yǎng)基：是否澄清（渾濁、出現(xiàn)沉淀或絮狀物提示污染）、顏色是否異常（如變黃、變綠）；
固體平板：表面是否有霉菌菌落（白色、綠色、黑色斑點(diǎn)）、是否吸潮黏膩（高濕度導(dǎo)致的霉菌易生長(zhǎng)）、是否有針尖大小的細(xì)菌菌落（芽孢萌發(fā)）；
空白對(duì)照驗(yàn)證：每月隨機(jī)抽取 1-2 瓶/皿未接種的培養(yǎng)基，在常規(guī)培養(yǎng)條件下（如 37℃、24-48 小時(shí)）培養(yǎng)，若無菌生長(zhǎng)，說明儲(chǔ)存環(huán)境和密封有效；若出現(xiàn)菌落，需立即排查儲(chǔ)存設(shè)備（如冰箱是否污染）和操作流程（如分裝是否無菌）。
2、污染后應(yīng)急處理
發(fā)現(xiàn)污染的培養(yǎng)基立即密封，單獨(dú)放置在生物危害垃圾袋中，高壓滅菌（121℃、30 分鐘）后廢棄，避免污染擴(kuò)散；
若同一批次多瓶/皿培養(yǎng)基污染，需追溯制備過程（如滅菌參數(shù)、分裝環(huán)境），同時(shí)徹底清潔儲(chǔ)存設(shè)備（含氯消毒劑 + 紫外線消毒）；
若儲(chǔ)存設(shè)備內(nèi)出現(xiàn)大量霉菌，需清空設(shè)備，用 5% 次氯酸鈉溶液擦拭內(nèi)壁，靜置 30 分鐘后用無菌水沖洗，晾干后紫外線消毒 1 小時(shí)，通風(fēng)后再使用。
四、不同類型培養(yǎng)基的針對(duì)性防污染措施
培養(yǎng)基類型 污染風(fēng)險(xiǎn)特點(diǎn) 專項(xiàng)防污染措施
液體培養(yǎng)基 易吸收空氣雜菌、沉淀后易滋生細(xì)菌，污染后渾濁明顯 1.密封時(shí)纏繞 parafilm 膜，減少空氣接觸；2.分裝為小體積（≤100mL），避免反復(fù)開啟；3.4℃儲(chǔ)存不超過 2 周，冷凍儲(chǔ)存需避免反復(fù)凍融。
固體平板 表面積大，易吸潮、霉菌孢子易沉降，封口不嚴(yán)時(shí)污染率高 1.倒置貼封口膜，減少表面水珠和雜菌附著；2.儲(chǔ)存時(shí)避免堆疊過高（≤5 層），保證通風(fēng)；3.取出使用前，用 75% 酒精擦拭皿蓋外側(cè)，室溫平衡 30 分鐘。
選擇性培養(yǎng)基 抗生素降解后無法抑制雜菌，雜菌易過度生長(zhǎng) 1.抗生素現(xiàn)配現(xiàn)加（培養(yǎng)基冷卻至 50℃以下時(shí)加入），避免提前添加后儲(chǔ)存；2.4℃密封避光儲(chǔ)存，1 周內(nèi)使用；3.儲(chǔ)存前檢測(cè)抗生素活性。
血清培養(yǎng)基 血清營(yíng)養(yǎng)豐富，易滋生細(xì)菌、真菌，且血清蛋白易變性導(dǎo)致污染風(fēng)險(xiǎn)升高 1.-20℃冷凍儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融；2.解凍后 4℃儲(chǔ)存不超過 3 天，未用完的血清需重新冷凍；3.加入血清后需立即使用，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫放置。
厭氧培養(yǎng)基 還原劑氧化后厭氧環(huán)境破壞，兼性厭氧菌易滋生 1.用密封厭氧罐儲(chǔ)存，罐內(nèi)放置厭氧指示劑；2.4℃避光儲(chǔ)存，1 周內(nèi)使用；3.儲(chǔ)存時(shí)避免打開密封蓋，使用前檢查還原劑顏色。
五、關(guān)鍵操作誤區(qū)規(guī)避
常見誤區(qū) 風(fēng)險(xiǎn)后果 正確做法
培養(yǎng)基未完全冷卻即密封儲(chǔ)存 內(nèi)部水蒸氣冷凝，導(dǎo)致表面吸潮、霉菌滋生 液體培養(yǎng)基冷卻至室溫（25℃左右），固體平板完全凝固后（約 2-4 小時(shí)）再密封。
儲(chǔ)存時(shí)培養(yǎng)基瓶口/皿蓋未密封 空氣雜菌（霉菌孢子、細(xì)菌芽孢）直接進(jìn)入，污染率升高 試劑瓶擰緊 + parafilm 膜纏繞，平板倒置 + 封口膜密封（留微小透氣孔）。
冷藏柜內(nèi)堆放過滿，通風(fēng)不良 局部濕度升高、溫度不均，霉菌易滋生，且取放時(shí)易碰撞導(dǎo)致培養(yǎng)基滲漏污染 培養(yǎng)基之間留 1-2cm 間隙，分層存放，避免堵塞冷藏柜通風(fēng)口。
重復(fù)使用污染培養(yǎng)基的儲(chǔ)存空間 殘留雜菌擴(kuò)散，導(dǎo)致新儲(chǔ)存的培養(yǎng)基交叉污染 污染培養(yǎng)基立即高壓滅菌廢棄，儲(chǔ)存空間用 75% 酒精 + 紫外線消毒后再放入新培養(yǎng)基。
忽視儲(chǔ)存前的質(zhì)量檢查 初始污染的培養(yǎng)基儲(chǔ)存后污染擴(kuò)散，影響其他培養(yǎng)基 制備后密封前，檢查培養(yǎng)基外觀（液體澄清、固體凝固良好），必要時(shí)做空白培養(yǎng)驗(yàn)證。
總結(jié)
儲(chǔ)存過程中避免微生物污染的核心邏輯是：切斷雜菌入侵路徑（密封 + 無菌環(huán)境）、抑制殘留芽孢萌發(fā)（控制溫度/時(shí)間）、避免交叉污染（分類存放）。通過標(biāo)準(zhǔn)化滅菌與分裝操作、規(guī)范儲(chǔ)存環(huán)境（4℃密封避光、濕度 40%-60%）、控制儲(chǔ)存時(shí)間（按類型 1-6 個(gè)月內(nèi)使用）、定期巡檢與空白驗(yàn)證，可將污染率降至 1% 以下，確保培養(yǎng)基的無菌性和有效性。
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