食品中創(chuàng)傷弧菌初步鑒定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及操作指南！
小楊 / 2026-01-15 10:07:12
食品中
創(chuàng)傷弧菌初步鑒定需覆蓋樣品前處理、分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)全流程，通過設(shè)置對(duì)照、驗(yàn)證培養(yǎng)基適用性、規(guī)范操作參數(shù)等方式，確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)如下：
一、樣品前處理階段質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
1、試劑與耗材質(zhì)控
堿性蛋白胨水（APW）含 3% NaCl，pH 值需控制在 8.4±0.2，高壓滅菌后無渾濁、無沉淀；培養(yǎng)基需在有效期內(nèi)使用，開封后避光保存。
無菌均質(zhì)袋、移液管等耗材需經(jīng)滅菌驗(yàn)證（121℃，20min），使用前檢查包裝完整性，避免污染。
2、增菌條件質(zhì)控
培養(yǎng)溫度嚴(yán)格為 30℃±1℃，振蕩轉(zhuǎn)速 150r/min±10r/min，培養(yǎng)時(shí)間 18~24h，不得超過 24h（防止雜菌過度繁殖）。
3、對(duì)照設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)
陽性對(duì)照：取 25g 無菌樣品基質(zhì)，加入 10? CFU/mL 創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（
ATCC 27562），同法增菌后，分離培養(yǎng)需檢出目標(biāo)菌株，菌落數(shù)符合預(yù)期回收率（≥70%）。
陰性對(duì)照：用無菌生理鹽水替代食品樣品，全程同法操作，增菌液涂布后無菌落生長(zhǎng)。
空白對(duì)照：未接種的 APW 培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng) 24h，無細(xì)菌生長(zhǎng)。
二、分離培養(yǎng)階段質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
1、選擇性培養(yǎng)基質(zhì)控
培養(yǎng)基類型 適用性驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn) 質(zhì)量判定
TCBS 瓊脂 接種副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（
ATCC 17802），形成黃色菌落；接種創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，形成綠色菌落；革蘭氏陽性菌（如
金黃色葡萄球菌）不生長(zhǎng) 培養(yǎng)基顏色為綠色，無干裂、無雜菌污染，驗(yàn)證菌株生長(zhǎng)特征符合預(yù)期
科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基 創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株形成藍(lán)綠色/藍(lán)紫色菌落；副溶血性弧菌形成粉色菌落；大腸埃希菌不生長(zhǎng) 菌落顯色清晰，背景無雜色，與說明書描述一致
2、接種與培養(yǎng)質(zhì)控
梯度稀釋時(shí)，移液管需一管一換，避免交叉污染；涂布量為 100μL /平板，涂布均勻，確保菌落分散（菌落數(shù)控制在 30~300 CFU /平板）。
培養(yǎng)溫度 30℃±1℃，培養(yǎng)時(shí)間 24h±2h；培養(yǎng)箱需定期校準(zhǔn)溫度，避免溫差導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)異常。
3、菌落純度質(zhì)控
挑取疑似菌落前，需觀察菌落形態(tài)均一性；挑取后涂片鏡檢，革蘭氏染色結(jié)果需一致，無雜菌混入。
三、形態(tài)學(xué)觀察階段質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
1、革蘭氏染色質(zhì)控
染色試劑質(zhì)控：結(jié)晶紫、碘液、95% 乙醇、番紅需在有效期內(nèi)，試劑顏色正常（如碘液為棕褐色，無沉淀）。
染色結(jié)果驗(yàn)證：采用
大腸埃希菌（革蘭氏陰性，紅色）和
金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性，紫色）作為質(zhì)控菌株，染色結(jié)果需準(zhǔn)確無誤。
操作參數(shù)質(zhì)控：脫色時(shí)間嚴(yán)格控制在 20~30s，過長(zhǎng)易造成革蘭氏陽性菌假陰性，過短易造成革蘭氏陰性菌假陽性。
2、動(dòng)力觀察質(zhì)控
懸滴法操作時(shí)，載玻片和蓋玻片需潔凈無油污；菌液濃度適中（OD???=0.5 左右），避免濃度過高導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)觀察不清。
陽性對(duì)照：
創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株需表現(xiàn)為活潑的穿梭樣運(yùn)動(dòng)；陰性對(duì)照：經(jīng)甲醛固定的創(chuàng)傷弧菌，無運(yùn)動(dòng)能力。
四、生化試驗(yàn)階段質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
1、生化培養(yǎng)基質(zhì)控
所有生化培養(yǎng)基（氧化酶試紙、嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基、脫羧酶培養(yǎng)基等）需在有效期內(nèi)使用，開封后密封保存，防止成分變質(zhì)。
脫羧酶培養(yǎng)基需添加無菌液體石蠟（覆蓋液面 1~2mm），創(chuàng)造厭氧環(huán)境；培養(yǎng)基初始 pH 值符合說明書要求（如賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基 pH 6.0±0.2）。
2、試驗(yàn)對(duì)照設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)
每批次生化試驗(yàn)需同步設(shè)置以下對(duì)照，確保試驗(yàn)體系有效：
試驗(yàn)項(xiàng)目 陽性對(duì)照菌株 陰性對(duì)照菌株 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
3、結(jié)果判定質(zhì)控
生化試驗(yàn)結(jié)果需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀取（培養(yǎng) 24h），超過時(shí)間易導(dǎo)致假陽性（如脫羧酶試驗(yàn)延遲顯色）。
同一菌株需至少重復(fù) 2 次生化試驗(yàn)，結(jié)果一致方可判定，避免單次操作誤差。
五、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與人員質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
1、環(huán)境質(zhì)控
無菌操作間需定期進(jìn)行空氣沉降菌檢測(cè)（≤10 CFU /皿，30min），工作臺(tái)面用 75% 乙醇消毒，避免交叉污染。
實(shí)驗(yàn)用具需分類滅菌，弧菌培養(yǎng)物需經(jīng)高壓滅菌（121℃，30min）后再處理，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
2、人員質(zhì)控
操作人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，熟練掌握革蘭氏染色、生化試驗(yàn)等操作技能，通過質(zhì)控菌株考核后方可獨(dú)立操作。
定期開展人員比對(duì)試驗(yàn)：同一食品樣品由不同人員平行鑒定，結(jié)果一致性需≥95%。
六、質(zhì)量控制結(jié)果判定原則
所有對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，本次鑒定結(jié)果有效；若任一對(duì)照失敗，需重新進(jìn)行試驗(yàn)，并排查失敗原因（如培養(yǎng)基失效、溫度偏差、操作污染等）。
疑似菌株的形態(tài)學(xué)和生化特征需全部符合
創(chuàng)傷弧菌典型特征，方可判定為初步鑒定陽性；若有一項(xiàng)特征不符，需重新挑取菌落驗(yàn)證，或排除該菌株。
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