微生物檢測和分離純化實驗注意事項之無菌操作與梯度控制！
小楊 / 2026-01-27 10:06:50
百歐博偉生物：微生物檢測和分離純化實驗的注意事項，核心圍繞無菌操作、梯度控制、培養(yǎng)條件、結(jié)果準確性四大維度，任何環(huán)節(jié)的疏漏都可能導致實驗失敗或結(jié)果偏差。
一、無菌操作：杜絕雜菌污染（實驗成功的前提）
這是整個實驗最關(guān)鍵的注意事項，所有操作都需圍繞“避免雜菌混入”展開：
1、工具滅菌要徹底：
接種環(huán)、涂布棒：每次使用前后必須在酒精燈火焰上灼燒至紅熱，冷卻 30 秒后再接觸菌液或培養(yǎng)基（避免高溫殺死目標微生物）。
移液器吸頭、培養(yǎng)皿、無菌水：需提前通過高壓蒸汽滅菌（121℃、1.05kg/cm²、20 分鐘），且開封后僅限單次使用。
2、操作環(huán)境控菌：
全程在酒精燈火焰周圍 10cm 內(nèi)進行（火焰形成的無菌區(qū)可阻擋空氣中的雜菌），不要對著培養(yǎng)基或菌液說話、呼氣。
倒培養(yǎng)基時，培養(yǎng)皿蓋僅打開一條縫隙，倒入后迅速蓋好，避免長時間暴露在空氣中。
3、手部與樣本處理：
實驗前用 75% 酒精擦拭雙手，避免手部細菌污染工具。
樣本（如土壤、水樣）取樣時，需用無菌容器盛裝，取樣工具（如需提前滅菌。
二、樣本稀釋：確保菌落可計數(shù)、可分離
稀釋環(huán)節(jié)直接影響后續(xù)菌落計數(shù)的準確性和單菌落的獲取，需注意以下 3 點：
1、稀釋梯度合理選擇：
根據(jù)樣本污染程度調(diào)整：土壤、污水等微生物密集的樣本，需稀釋至10?³~10??；空氣、潔凈物體表面等微生物較少的樣本，稀釋至10?~10?²即可。
若稀釋度過高（如 10??），平板上菌落太少（<30 個），計數(shù)誤差大；稀釋度過低（如 10?¹），菌落重疊（>300 個），無法區(qū)分單菌落。
2、稀釋操作規(guī)范：
每次稀釋時，移液器吸取的菌液需完全注入無菌水中，且混勻至少 10 秒（可通過顛倒離心管或振蕩實現(xiàn)），確保微生物均勻分散。
稀釋過程中，離心管蓋需倒扣在實驗臺（避免內(nèi)表面接觸臺面污染），操作完成后立即蓋緊。
3、避免交叉污染：
不同稀釋度的離心管需做好標記（如 10?¹、10?²），且移液器吸頭需更換，不可重復使用。
三、培養(yǎng)與接種：保障微生物正常生長
接種和培養(yǎng)條件需匹配微生物的生長需求，否則可能導致菌落不生長或形態(tài)異常：
1、接種量與涂布技巧：
涂布接種時，每塊平板僅滴加0.1mL 菌液（菌液過多會導致菌落連片，過少則菌落稀疏）。
涂布棒需輕輕在培養(yǎng)基表面滑動，避免劃破培養(yǎng)基（劃破會導致菌落生長在縫隙中，無法計數(shù)）。
2、培養(yǎng)條件精準控制：
溫度：細菌用 37℃恒溫培養(yǎng)（多數(shù)細菌最適溫度），真菌用 28℃（多數(shù)真菌最適溫度），不可混淆（如真菌在 37℃下可能不生長）。
時間：細菌培養(yǎng) 18-24 小時（時間過長會導致菌落過度繁殖、邊緣融合），真菌培養(yǎng) 3-5 天（生長速度慢，需足夠時間形成可見菌落）。
倒置培養(yǎng)：所有平板需倒置放入培養(yǎng)箱（避免培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的冷凝水滴落，沖散菌落或?qū)е码s菌滋生）。
3、空白對照不可少：
必須設(shè)置“空白對照平板”（只加 0.1mL 無菌水，不接種樣本），若對照平板長出菌落，說明培養(yǎng)基或無菌水被污染，整個實驗需重做。
四、分離純化與結(jié)果記錄：確保菌種單一、數(shù)據(jù)可靠
1、單菌落挑取技巧：
挑取時優(yōu)先選擇邊緣清晰、形態(tài)完整的單菌落（避免挑取重疊或邊緣模糊的菌落，可能含雜菌）。
每次挑取不同形態(tài)的菌落前，接種環(huán)需重新灼燒滅菌，防止不同菌種交叉污染。
2、劃線純化規(guī)范：
采用“分區(qū)劃線法”：先在培養(yǎng)基一側(cè)劃 1-2 條直線，轉(zhuǎn)動平板 45°，從第一條線的末端開始劃第二條線，重復 3-4 次（逐步稀釋菌體，最終可形成單菌落）。
劃線時力度要輕，避免接種環(huán)劃破培養(yǎng)基，且線條間保持一定距離，便于單菌落形成。
3、結(jié)果記錄要詳細：
記錄菌落的數(shù)量、顏色、形狀（圓形/不規(guī)則形）、表面狀態(tài)（光滑/粗糙）、邊緣（整齊/鋸齒狀）、透明度（透明/半透明） ，這些特征是后續(xù)菌種鑒定的重要依據(jù)。
若同一平板上出現(xiàn)多種形態(tài)的菌落，需分別挑取純化，不可混合培養(yǎng)。
五、實驗后處理：避免環(huán)境污染與安全風險
1、廢棄材料處理：
用過的培養(yǎng)皿、吸頭、接種環(huán)等，需放入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后再丟棄（避免微生物擴散到環(huán)境中）。
剩余的菌液、培養(yǎng)基需徹底滅菌后再倒入下水道，不可直接排放。
2、儀器清潔與整理：
實驗結(jié)束后，用 75% 酒精擦拭實驗臺，移液器、恒溫培養(yǎng)箱等儀器需清潔后歸位，保持實驗室整潔。
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