稀釋平板計數(shù)法的原理與操作流程及注意事項有哪些？
小楊 / 2026-01-28 10:18:18
百歐博偉生物：稀釋平板計數(shù)法的核心是通過無菌操作、精準稀釋、均勻分離實現(xiàn)活菌定量，其注意事項需貫穿實驗全流程（準備、稀釋、接種、培養(yǎng)、計數(shù)），既要避免污染和誤差，也要確保結果的準確性和可重復性。以下是按實驗環(huán)節(jié)梳理的關鍵注意事項及原理說明，方便實操中對照執(zhí)行：
一、實驗準備階段：筑牢無菌與適配基礎
1、無菌器材與試劑的預處理
滅菌徹底性：所有器材（試管、培養(yǎng)皿、移液管、吸頭）、稀釋液（生理鹽水/PBS）、培養(yǎng)基均需高壓蒸汽滅菌（121℃，15min），滅菌后需檢查包裝完整性（如培養(yǎng)皿包是否破損），避免二次污染。
稀釋液選擇適配：
常規(guī)細菌用 0.85% 無菌生理鹽水（維持滲透壓，避免細胞破裂）；
敏感菌（如
乳酸菌、
鏈球菌）用無菌 PBS 緩沖液（pH 更穩(wěn)定，減少滲透壓沖擊）；
真菌/酵母菌可用無菌水或相應液體培養(yǎng)基（如 YPD 液體培養(yǎng)基），避免高鹽抑制生長。
培養(yǎng)基狀態(tài)控制：
融化后冷卻至 45~50℃（手感不燙手，滴腕內側無刺痛），溫度＞60℃會殺死活菌，＜40℃會凝固導致無法與菌液混合；
避免培養(yǎng)基反復融化（營養(yǎng)成分破壞，瓊脂凝固性下降），未用完的融化培養(yǎng)基可 4℃暫存，再次使用前需重新融化并冷卻至 45℃。
2、超凈工作臺與環(huán)境消毒
紫外線消毒 30min 后需開啟通風扇 5~10min（排除臭氧，避免損傷人體和微生物）；
臺面用 75% 酒精擦拭（包括酒精燈、移液器、試管架），操作人員穿戴無菌手套、口罩，雙手酒精消毒后再操作；
實驗期間禁止無關人員走動、說話，避免空氣流動帶來的雜菌污染。
二、梯度稀釋階段：控制誤差的核心環(huán)節(jié)
1、稀釋液與移液操作精準性
每管稀釋液體積嚴格為 9mL（誤差≤0.1mL），用校準過的移液管或移液器量取，避免稀釋倍數(shù)偏差；
移液時吸頭/移液管尖端靠近液面下方，緩慢吸取，避免產(chǎn)生氣泡（氣泡會導致吸量不足）；釋放液體時貼壁緩慢注入，避免濺出。
2、混勻與交叉污染防控
每一步稀釋后必須充分混勻：用漩渦振蕩器振蕩 1~2min，或手捏試管顛倒 10~15 次（確保菌液與稀釋液完全融合，避免局部濃度不均）；振蕩后靜置 1~2min，待氣泡消散再進行下一步稀釋；
每一次稀釋必須更換新吸頭/移液管（或移液管灼燒冷卻后使用），嚴禁同一吸頭用于不同稀釋度（避免高濃度菌液帶入低濃度管，導致稀釋失效）。
3、稀釋節(jié)奏與樣品處理
稀釋過程連續(xù)進行，避免中途停頓（高濃度菌液長時間暴露在空氣中易聚集，或因 pH、溫度變化影響活性）；
固體樣品（如土壤、食品）需提前制備均勻懸液：稱取樣品后加入無菌稀釋液，振蕩 30min 后用無菌紗布過濾（去除雜質），取上清液進行稀釋，避免雜質影響菌落觀察。
三、傾注平板與接種階段：確保菌落均勻分離
1、培養(yǎng)皿標記與平行樣設置
每個培養(yǎng)皿需清晰標記：樣品名稱、稀釋度、接種日期、操作者（避免混淆）；
每個稀釋度至少設置 3 個平行平板（減少隨機誤差），平行樣接種條件需完全一致（接種體積、培養(yǎng)基量、混勻方式）。
2、接種體積與培養(yǎng)基傾注技巧
接種體積通常為 0.1mL 或 1mL：菌液濃度高時用 0.1mL（避免菌落過多），濃度低時用 1mL（提高菌落檢出率），體積需準確且統(tǒng)一；
傾注培養(yǎng)基時速度適中，每皿倒入 15~20mL（剛好覆蓋皿底，厚度均勻），倒入后立即輕輕旋轉培養(yǎng)皿（順時針 + 逆時針各 3 圈，幅度不宜過大），使菌液均勻分散在培養(yǎng)基中（避免菌液聚集在中央導致菌落重疊）；
若培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡，可輕輕敲擊培養(yǎng)皿邊緣排出氣泡（氣泡會遮擋菌落或導致菌落形態(tài)異常）。
3、凝固與倒置處理
接種后將培養(yǎng)皿平放在超凈工作臺中，開蓋通風 1~2min（去除冷凝水），再蓋緊蓋子；
待培養(yǎng)基完全凝固（約 15~20min，觸摸皿底無粘膩感）后，立即倒置放置（避免培養(yǎng)過程中冷凝水滴落污染菌落，或導致菌落擴散重疊）。
四、培養(yǎng)與計數(shù)階段：規(guī)范統(tǒng)計標準
1、培養(yǎng)條件適配
按微生物最適條件培養(yǎng)：細菌 37℃培養(yǎng) 18~24h，酵母菌 28℃培養(yǎng) 48~72h，真菌需延長至 72~96h（培養(yǎng)時間不足會導致菌落過小無法計數(shù)，過長會導致菌落重疊或雜菌過度生長）；
厭氧菌需在厭氧培養(yǎng)箱中進行，避免因氧氣抑制導致無菌落生長。
2、菌落計數(shù)規(guī)范
嚴格遵循“30~300 菌落數(shù)”原則：僅選擇菌落數(shù)在該范圍的平板計數(shù)（低于 30 誤差率＞10%，高于 300 菌落重疊無法區(qū)分）；
計數(shù)時用菌落計數(shù)器輔助，肉眼觀察并標記單菌落：邊緣清晰、獨立生長的為有效菌落；鏈狀生長的細菌（如
鏈球菌），單鏈≤3 個細胞按 1 個菌落計數(shù)，＞3 個細胞需注明計數(shù)方式；微小菌落或透明菌落可借助放大鏡觀察，避免漏數(shù)或重復計數(shù)；
空白對照驗證：設置“無菌稀釋液 + 培養(yǎng)基”的空白平板，同條件培養(yǎng)后若出現(xiàn)菌落，說明器材、試劑或操作污染，需重新實驗。
3、異常平板處理
若同一稀釋度的 3 個平行平板菌落數(shù)差異過大（超出平均值的 ±20%），需排查原因（如混勻不充分、接種誤差、污染），剔除異常平板后重新計算平均值，或直接重新實驗；
若所有稀釋度平板菌落數(shù)均＜30，說明稀釋倍數(shù)過高，需減少稀釋級數(shù)（如從 10??調整為 10?³）；若均＞300，說明稀釋倍數(shù)不足，需增加稀釋級數(shù)（如從 10??調整為 10??）。
五、結果計算與記錄階段：確保數(shù)據(jù)可追溯
1、計算邏輯與單位規(guī)范
原始菌液濃度公式：CFU/mL = 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積（mL），計算時需注意稀釋倍數(shù)為“最終稀釋度”（如 10??稀釋管接種，稀釋倍數(shù)為 10?）；
結果保留 1~2 位有效數(shù)字（如 4.8×10? CFU/mL，而非 48333333 CFU/mL），單位必須標注“CFU/mL”（菌落形成單位），不可簡寫為“個/mL”（避免誤解為絕對活菌數(shù)）。
2、記錄完整性
記錄內容需包含：樣品信息（來源、預處理方式）、稀釋梯度設置、各平板菌落數(shù)、平均菌落數(shù)、原始濃度、培養(yǎng)條件（溫度、時間、氣體環(huán)境）、培養(yǎng)基類型、誤差分析（如異常平板原因），確保實驗可重復和數(shù)據(jù)可追溯。
六、常見風險點額外提醒
雜菌污染：若平板出現(xiàn)與目標菌落形態(tài)不同的雜菌，需排查無菌操作流程（如超凈臺消毒不徹底、器材滅菌失效、操作者手部污染），重新實驗；
菌落形態(tài)異常：若菌落過小、透明或邊緣模糊，可能是培養(yǎng)基營養(yǎng)不足、培養(yǎng)時間不夠或溫度不適，需調整培養(yǎng)基配方或培養(yǎng)條件；
菌液活性影響：待測菌液需新鮮制備，避免長時間存放（尤其是厭氧菌、敏感菌，存放會導致活菌數(shù)下降），若需暫存，需 4℃冷藏并在 24h 內完成實驗。
總結
稀釋平板計數(shù)法的注意事項可概括為“無菌是前提、精準是核心、均勻是關鍵、規(guī)范是保障”。實操中需嚴格把控每一個環(huán)節(jié)，減少污染和誤差，確保計數(shù)結果真實反映樣品中的活菌濃度。若出現(xiàn)實驗失敗，可對照上述注意事項逐一排查，重點關注稀釋倍數(shù)、混勻操作、無菌控制和培養(yǎng)條件四大核心要素。
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