首次利用CRISPR-Cas9對(duì)古生菌進(jìn)行基因組編輯
中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) / 2017-03-13 08:36:00
在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)伊利諾伊大學(xué)厄巴納-香檳分校的微生物學(xué)教授BillMetcalf和博士后研究員DiptiNayak首次記錄了在古生菌（Archaea，也譯作古細(xì)菌，或古菌）中使用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯。他們的突破性工作有潛力在未來(lái)極大地加快研究這類(lèi)有機(jī)體，包括對(duì)全球氣候變化的影響。
Nayak解釋道，“在大多數(shù)情形下，作為我們的模式古生菌，乙酸甲烷八疊球菌（Methanosarcinaacetivorans）的倍增時(shí)間是8到10小時(shí)，而大腸桿菌能夠在大約30分鐘內(nèi)增殖一倍。這意味著進(jìn)行遺傳學(xué)研究和獲得突變體能夠需要數(shù)月時(shí)間，而同樣的事情在
大腸桿菌中開(kāi)展僅需三天。在通常情況下，CRISPR-Cas9能夠讓我們做的事情就是加快這整個(gè)過(guò)程。它解決了一個(gè)重大的瓶頸：在這種古生菌中開(kāi)展遺傳學(xué)研究?！?
Nayak繼續(xù)說(shuō)道，“再者，利用我們之前的技術(shù)，必須一步一步地引入突變。利用這種新的技術(shù)，我們能夠同時(shí)引入多種突變。我們能夠利用CRISPR指數(shù)級(jí)地?cái)U(kuò)大這個(gè)突變體產(chǎn)生過(guò)程。”
CRISPR起初是作為細(xì)菌和古生菌中的一種免疫防御系統(tǒng)發(fā)揮作用。通過(guò)鑒定出和儲(chǔ)存短的外源病毒DNA片段，Cas蛋白能夠在未來(lái)快速地識(shí)別這種DNA片段，也因此能夠快速地破壞這種DNA片段，從而保護(hù)細(xì)菌和古生菌免受病毒再次入侵。
自從發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9以來(lái)，它就經(jīng)過(guò)改進(jìn)在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)基因組進(jìn)行編輯。通過(guò)將Cas9與一種經(jīng)過(guò)特定改造的向?qū)NA（gRNA）配合使用，這種CRISPR系統(tǒng)能夠在任意位點(diǎn)上切割細(xì)胞的基因組以至于能夠移除現(xiàn)存的基因或者加入新的基因。這種系統(tǒng)已被廣泛地用于編輯真核系統(tǒng)，如
酵母，植物，魚(yú)，甚至人細(xì)胞。然而，在原核生物中使用這種系統(tǒng)遇到了障礙，這部分上是由于它們的不同的細(xì)胞過(guò)程。
為了在細(xì)胞中使用CRISPR系統(tǒng)，研究人員必須開(kāi)發(fā)出一種將細(xì)胞偏好的DNA修復(fù)系統(tǒng)考慮在內(nèi)的操作方法：在CRISPR“分子剪刀”切割染色體后，細(xì)胞的修復(fù)系統(tǒng)介入進(jìn)來(lái)，通過(guò)一種能夠被用來(lái)移除或添加附加的遺傳物質(zhì)的機(jī)制修復(fù)這種DNA損傷。在真核細(xì)胞中，這種修復(fù)機(jī)制為非同源末端連接（Non-HomologousEndJoining,NHEJ）。盡管這種機(jī)制用于CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯中，但是它往往在修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生遺傳錯(cuò)誤：作為DNA梯子中的橫檔，核苷酸經(jīng)常在切割位點(diǎn)上被加入或移除。
NHEJ機(jī)制在包括古生菌在內(nèi)的原核生物中是非常罕見(jiàn)的；相反，它們的DNA損傷更多的時(shí)候是通過(guò)一種被稱(chēng)作同源重組修復(fù)（homology-directedrepair,HDR）的機(jī)制加以修復(fù)的。通過(guò)將DNA損傷與一種DNA模板進(jìn)行比較，HDR機(jī)制獲得一種“確定性的模板”，其最終結(jié)果能夠被提前預(yù)測(cè)，并且能夠按照研究人員的需要加以精確地調(diào)整。
Nayak解釋道，在很多方面，HDR機(jī)制確實(shí)適合于基因組編輯：“由于NHEJ的存在，我們想要在真核生物中利用CRISPR-Cas9進(jìn)行定向編輯。就這點(diǎn)而言，大多數(shù)古生菌菌株并沒(méi)有NHEJ機(jī)制倒是個(gè)好消息，因此，它們的唯一能夠修復(fù)DNA的途徑就是這種確定性的同源修復(fù)機(jī)制（即HDR）?！?
盡管看起來(lái)似乎違反直覺(jué)，Nayak和Metcalf的首批CRISPR-Cas9應(yīng)用之一就是在乙酸甲烷八疊球菌中引入NHEJ機(jī)制。Nayak說(shuō)，盡管通常不大適合用于基因組編輯，但是NHEJ也有優(yōu)于HDR機(jī)制的地方：“如果你僅想要移除一個(gè)基因，如果不在乎如何移除...，那么NHEJ機(jī)制實(shí)際上更加高效?！?
Nayak說(shuō)，通過(guò)這種引入的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)開(kāi)展基因敲除研究，即單個(gè)基因被移除或沉默以便觀察會(huì)產(chǎn)生什么變化和這個(gè)基因可能影響哪些過(guò)程，未來(lái)的研究將能夠組裝出乙酸甲烷八疊球菌和其他的古生菌物種的基因圖譜。
Nayak說(shuō)，“乙酸甲烷八疊球菌是遺傳上最容易處理的古生菌菌株之一。產(chǎn)
甲烷菌是一類(lèi)每年產(chǎn)生幾十億噸這種強(qiáng)效溫室氣體的古生菌，在全球碳循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，因此顯著地促進(jìn)全球氣候變化?！蓖ㄟ^(guò)研究乙酸甲烷八疊球菌（也是一種產(chǎn)甲烷菌）和其他的有機(jī)體，Nayak和Metcalf希望能夠更加深入地理解古生菌遺傳學(xué)特征以及它們?cè)诟訌V泛的環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮的作用。
總之，這項(xiàng)研究代表著研究和操縱古生菌的一個(gè)激動(dòng)人心的新方向。Nayak作出結(jié)論，“我們開(kāi)展這項(xiàng)研究的目的在于確定在古生菌中進(jìn)行CRISPR-Cas9基因組編輯是否是可行的。我們發(fā)現(xiàn)這不僅是可行的，而且它表現(xiàn)得非常好，甚至可與真核生物中的表現(xiàn)相比擬。”
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