百歐博偉對(duì)志賀氏菌的檢驗(yàn)情況-ATCC菌種
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-09-11 16:05:27
百歐博偉對(duì)志賀氏菌的檢驗(yàn)情況-ATCC菌種
1.范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中志賀氏菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品和食物中毒樣品中志賀氏菌的檢驗(yàn)。
2.規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的墩新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.設(shè)備和材料
3.1冰箱：0℃～4℃。
3.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃士1℃，42℃。
3.3顯微鏡：10*～l00*。
3.4均質(zhì)器或滅菌乳缽。
3.5架盤藥物天平：0g一500g，精確至0.5g。
3.6滅菌廣口瓶：500mL。
3.7滅菌錐形瓶：500mL、250mL。
3.8滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。
3.9硝酸纖維素濾膜：150mm*50mm，Φ0.45um。臨用時(shí)切成兩張，每張70mm*50mm，用鉛筆劃格，每格6mm*6mm。每行10格，分6行。滅菌備用。
4.培養(yǎng)基和試荊
4.1 GN增菌液：按GB/T4789.28一2003中4.17規(guī)定。
4.2 HE瓊脂：按GB/T4789.23一2003中4.21規(guī)定．
4.3 SS瓊脂：按GB/T4789.28一2003中4.22規(guī)定。
4.4 麥康凱瓊脂：按GB/T4789.28一2003中4.24規(guī)定。
4.5 伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB)：按GB/T4789.28一2003中4.25規(guī)定。
4.6 三糖鐵瓊脂（TSI)：按GB/T4789.28一2003中4.26、4.27規(guī)定。
4.7 葡萄糖半固體管：按GB/T47名9.28一2003中連，31規(guī)定。
4.8 半固體管：按GB/T4789.28一2003中4.30規(guī)定。
4.9 葡萄糖錢瓊脂：按GB/T4789.28一2003中3.8規(guī)定。
4.10 尿素瓊脂（pH7.2)：按GB/T4789.28一2003中3.15規(guī)定。
4.11 西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂：按G曰T47豹．28一2。的中3.5規(guī)定。
4.12 氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基：按G酬T4789.28一2。。3中3.16規(guī)定。
4.13 氨基酸脫按酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：賴氨酸、鳥氨酸及對(duì)照培養(yǎng)基，按GB/T4789.28一2003中3.12規(guī)定。
4.14糖發(fā)酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七葉昔及水楊普，按GB/T4789.28一2003中3.2規(guī)定。
4.15 5％乳糖發(fā)酵管：按GB/T4789.28一2003中4.32規(guī)定
4.16蛋白豚水、靛基質(zhì)試劑：按GB/T4789,28一2003中3.13規(guī)定4.17志賀氏菌屬診斷血清。
5.檢驗(yàn)程序：志賀氏菌檢驗(yàn)程序見
6.操作步驟
6.1前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過(guò)前增菌。以無(wú)菌操作取器g(mL)，加在裝有225mL緩沖蛋白陳水的500mL廣口瓶?jī)?nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以8000r/min——10000r／min,或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃士1℃培養(yǎng)4h（干蛋品培養(yǎng)18h——24h)，移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h——24h。同時(shí)，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽朧氨酸增菌液內(nèi)，于36℃士1℃培養(yǎng)18h——24h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過(guò)前增菌。各取25g〔25mL）加人滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液；取25mL，接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌掖或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24h；另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽朧氨酸增菌液內(nèi)，于36℃士1℃培養(yǎng)18h——24h。
6.2分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸秘瓊脂平板和一個(gè)DHL瓊脂平板（或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板）。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于36℃士1℃分別培養(yǎng)18h——24h(DHL、HE、WS、SS）或4oh——48h(BS)，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，沙門氏菌I、II、IV、V、VI和沙門氏菌皿在各個(gè)平板上的菌落特征見表l。
6.3生化試驗(yàn)
6.3.1自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個(gè)可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在三糖鐵瓊脂內(nèi)。
6.3.2在接種三糖鐵瓊脂的同時(shí)，再接種蛋白膝水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀(KCN）培養(yǎng)基和賴氨酸脫叛酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)藻各一管，于36℃士1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48h，按表3判定結(jié)果。按反應(yīng)序號(hào)分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于Al、AZ和B1，其他5種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。
6.3.2.1反應(yīng)序號(hào)Al：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常，按表4可判定為沙門氏菌。如有兩項(xiàng)異常，則按A3判定為弗勞地氏檸檬酸桿菌。6.3.2.2反應(yīng)序號(hào)AZ：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，按表5判定結(jié)果。
6.3.2.3反應(yīng)序號(hào)Bl：補(bǔ)做ONPG。ONPG＋為大腸埃希氏菌，ONPG一為抄門氏菌。同時(shí)，沙門氏菌應(yīng)為賴氨酸＋，但甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸一。
6.3.2.4必要時(shí)按表6進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。
6.4血清學(xué)分型鑒定
6.4.1抗原的準(zhǔn)備一般采用1.5％瓊脂斜面培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗(yàn)用的抗原。O血清不凝集時(shí)，將菌株接種在瓊脂量較高的〔如2.5％一3%）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時(shí)，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時(shí)，將菌株接在0.7%——0.8％半固體瓊脂平板的中央，俠菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^(guò)裝有0.3%～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次一2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。
6.4.2 0抗原的鑒定用A——F多價(jià)。血清做玻片蔓集試驗(yàn)，同時(shí)用生理鹽水做對(duì)照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被A——F多價(jià)O血清凝集者，依次用04;03、10；07;08;09;02和011因子血清做凝集試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判定O群。被03、10。血清凝集的菌株，再用010、015、O34、019單因子血清做凝集試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，判定O群...被03、10血清凝集的菌株，再用010、015、034、019單因子血清做凝集試驗(yàn)，判定El、EZ、E3、E4各亞群，每一個(gè)O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)0單因子血清的檢查結(jié)果，沒(méi)有O單因子血清的要用兩個(gè)O復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)．不被A——F多價(jià)O血清凝集者，先用57種或163種沙門氏菌因子血清中的9種多價(jià)0血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價(jià)O血清所包括的O因子如下：O多價(jià)1 A,B,C,D,E,F群（并包括6,14群）0多價(jià)2 13,16,17,18,21群O多價(jià)3 28,30,35,38,39群O多價(jià)4 40,41,42,43群O多價(jià)5 44,45,47,48群O多價(jià)6 50,51,52,53群O多價(jià)7 55,56，弓7,58群O多價(jià)8 59,60,61,62群O多價(jià)9 63,65,66,67群6.4.3 H抗原的鑒定不常見的菌型，先用163種沙門氏菌因子血清中的8種多價(jià)H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集．則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以確定第1相和第2相的H抗原。8種多價(jià)H血清所包括的H因子如下：H多價(jià)l a,b,c,d,iH多價(jià)2 eh,enx,enz15，fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多價(jià)3 k,r,y,z,z10，Iv,lw,lz13,lz28，lz40
H多價(jià)4 1,2;1,5;1,6;l,7；z6
H多價(jià)5 z4z23；z4z24；z4z32；z29，z35，z36，z38。H多價(jià)6：z39，z41,z42,z44
H多價(jià)7 z32，z53,z54，z55H多價(jià)8 z56，z57,z60,z61，z62每一個(gè)H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒(méi)有H單因子血清的要用兩個(gè)H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對(duì)。檢出第1相H抗原而未檢出第z相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1代～2代后再檢查。如仍只檢出一個(gè)相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個(gè)相。單相菌不必做位相變異檢查。位相變異試驗(yàn)方法如下：小玻管法：將半固體管（每管約1mL——2ml）在酒精燈上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.lmL，加人于溶化的半周體內(nèi)，混勻后，用毛細(xì)吸管吸取分裝于供位相變異試驗(yàn)的小玻管內(nèi)，俊凝固后，用接種針挑取待檢菌，接種子一端。將小玻管平放在平皿內(nèi)，并在其旁放一團(tuán)濕棉花，以防瓊脂中水分蒸發(fā)而干縮，每天檢查結(jié)果，待另一相細(xì)菌解離后，可以從另一端挑取細(xì)菌進(jìn)行檢查。培養(yǎng)墓內(nèi)血清的濃度應(yīng)有適當(dāng)?shù)谋壤?，過(guò)高時(shí)細(xì)菌不能生長(zhǎng)，過(guò)低時(shí)同一相細(xì)菌的動(dòng)力不能抑制。一般按原血清l:200～1：800的量加人。小倒管法：將兩端開口的小玻管（下端開口要留一個(gè)缺口，不要平齊）放在半固體管內(nèi)，小玻管的上端應(yīng)高出于培養(yǎng)基的表面，滅菌后備用。臨用時(shí)在酒精燈上加熱溶化，冷至50℃，挑取因子血清1環(huán)，加入小套管中的半固體內(nèi)，略加攪動(dòng)，使其混勻，佼凝固后，將待檢菌株接種于小套管中的半固體表層內(nèi)，每天檢查結(jié)果，待另一相細(xì)菌解離后，可從套管外的半固體表面取菌檢查，或轉(zhuǎn)種1％軟瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)后再做凝集試驗(yàn)。簡(jiǎn)易平板法：將0.7%～0.8％半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1環(huán)，滴在半固體平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點(diǎn)種待檢菌株，培養(yǎng)后，在形成蔓延生長(zhǎng)的菌苔邊緣取菌檢查。
6.4.4 VI抗原的鑒定用vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有：傷寒沙門氏菌，丙型副傷寒沙門氏菌，都柏林沙門氏菌。6.5菌型的判定和結(jié)果報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照表7或有關(guān)沙門氏菌屬抗原表判定菌型，并報(bào)告結(jié)果。
中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部2012年5月17日最新頒部了GB4789.5-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌》，該標(biāo)準(zhǔn)于2012年7月17日起實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)已將志賀氏菌增菌條件改為：樣品25g（25ml），于225ml志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素中，于41.5℃厭氧培養(yǎng)16~20小時(shí)。該標(biāo)準(zhǔn)旨在提高志賀氏菌增菌環(huán)節(jié)的選擇性，以減少雜菌競(jìng)爭(zhēng)抑制與干擾，提高志賀氏菌的擴(kuò)增量，最終提高志賀氏菌的檢出率。由于即將面對(duì)大量250ml三角燒瓶的厭氧培養(yǎng)，常規(guī)的厭氧罐與厭氧袋均無(wú)法承擔(dān)，故厭氧工作站（或稱厭氧培養(yǎng)箱）即成為該增菌操作的首選設(shè)備。