BIOBW生物-菌種鑒定常見問題分析！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-12-21 08:30:40
1.菌種鑒定可以鑒定到種嗎？
16s rRNA作為菌種鑒定相似度超過97%一般定義為同一種菌。
如果是sanger測序獲得16s全長的都可以鑒定到種，甚至能區(qū)分亞種。有些細(xì)菌并不只有1個16s序列，會包含有1-15拷貝的16s序列，所以單一的16s序列鑒定可能會出現(xiàn)偏差。
利用高通量如454或miseq測序一般由于讀長的緣故，通常只有300-500多個堿基被測序，所以在物種鑒定上一般比較可靠的是能分類到屬，部分能分類到種。
根據(jù)我們的經(jīng)驗，不同的樣品會有大約10-50的菌能分類到種。利用新的分析方法，我們現(xiàn)在也可以利用16s rRNA的群落多樣性高通測序數(shù)據(jù)進(jìn)行亞種級別的分析。主要是利用16s中共同變化的SNP位點進(jìn)行分型。這樣可以大大提高菌種的分類精度，尤其是在有些菌株之間表型差異巨大的時候。
2.菌種鑒定的方法簡介
在做菌種鑒定之前，首先要確定待鑒定的菌種是不是純種，這也是至關(guān)重要的一步 。菌種不純是不會得到正確的結(jié)果的。純化方法，常用的有兩種。
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方法
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原理
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優(yōu)點
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缺點
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例如
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平板劃線分離法
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把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基，通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種
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可以觀察菌落特征，對混合菌進(jìn)行分離
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不能計數(shù)，一般用于從菌種的分離純化。
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篩選大腸桿菌菌種。
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稀釋涂布平板法
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將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。
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可以計數(shù)，可以觀察菌落特征。
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吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培養(yǎng)基的回收率計數(shù)。
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測定純凈水中大腸桿菌的含量。
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菌種鑒定的方法一般有常規(guī)鑒定和分子生物學(xué)方法：
（1）常規(guī)鑒定：菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、菌毛染色、糖類分解實驗、吲哚實驗、淀粉水解實驗、V-P實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽利用實驗、硝酸鹽還原實驗、接觸酶實驗等
（2）分子生物學(xué)方法：細(xì)菌16SrDNA菌種鑒定：提取DNA，特定引物PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化測序，進(jìn)化樹分析；真菌18S rDNA/ITS菌種鑒定流程也是一樣的。
3.文獻(xiàn)中未知菌鑒定中有菌落特征的觀察，為什么不指明用何種培養(yǎng)基、培養(yǎng)基狀態(tài)（固、液）及培養(yǎng)條件（時長、溫度）？
不同類型的菌在不同培養(yǎng)基上有顯著牲，尤其在顯色培養(yǎng)基上，更能一目了然，有輔助判定的作用；但未知菌無法確定在哪種培養(yǎng)基上生長好，以及生長條件等，所以食品安全控制中著重檢致病菌，比如檢驗是否有空腸彎曲菌，有一整套方法，42度，微厭氧條件比較合適，還要增菌；但未知菌不可能把這些條件都嘗試一下，我們的方法是全用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，如果需氧條件下不長，就再實驗一下厭氧條件，35度左右培養(yǎng)，時間以長出合適實驗的菌為宜.
4.菌種長時間保存后復(fù)蘇，如何鑒定有沒有改變？
(1).仔細(xì)觀察單菌落的形態(tài)結(jié)構(gòu)，比較該單菌落與目的菌單菌落的外在特征，或者查找目的菌特有的生理生化特性，比較現(xiàn)有菌，一般可以作出判斷。
(2).如果不能輕易判斷，建議對菌株的16sRNA的基因序列進(jìn)行測序，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，建立個系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，這樣可以精確的判斷菌株是否發(fā)生改變。
5.微生物的菌種鑒定可以鑒定到“株”一級嗎？
如果菌株是自然界中分離得到，就只能鑒定到種，不能鑒定到株，因為多多少少和其他株系的細(xì)菌有區(qū)別，即便你做了一些特征的鑒定，發(fā)現(xiàn)和某一株細(xì)菌一模一樣，你也沒有理由說你的細(xì)菌就是那一株細(xì)菌，因為你不可能把所有的特征都做完，株和株之間的關(guān)系就相當(dāng)于不同的人之間的關(guān)系，世界上不可能有完全相同的兩個人。除非你知道你的細(xì)菌本來就是某一株細(xì)菌擴(kuò)增出來的（而且要保證沒有變異，否則就是一個新株），可是這樣就沒必要鑒定了。
6.PCR擴(kuò)增切膠純化測序出現(xiàn)套峰是什么情況？
(1)測序結(jié)果個別堿基出現(xiàn)N，或者部分連續(xù)出現(xiàn)套峰，是由菌種rDNA多態(tài)性造成，對菌種鑒定無影響；
(2)所有測序反應(yīng)均出現(xiàn)大面積套峰，由于客戶提供樣品模板不純造成，這種情況需要客戶重新純化菌種或進(jìn)行TA克隆。
7.常規(guī)鑒定中，如何判斷菌種質(zhì)量？
(1).肉眼觀察：優(yōu)良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。
(2).優(yōu)良菌種標(biāo)準(zhǔn)可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，打開瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢查其含水量，看是否符合上述要求標(biāo)準(zhǔn)。
(3).顯微鏡檢查：挑取少量菌絲，置顯微鏡上觀察其形態(tài)，菌絲分枝，分隔情況，鎖狀聯(lián)合，細(xì)胞膜的厚薄。 培養(yǎng)觀察：從菌種瓶中挑取小塊菌絲體，接種斜面試管培養(yǎng)基上，置23℃～25℃恒溫中培養(yǎng)，經(jīng)五周后檢查菌種生活力。如果菌絲生長快，旺盛純一，健壯濃厚，長且整齊，則表示菌種的生活力強(qiáng)。
(4).分塊法：在桌上放一張白紙，把菌齡相同的菌種從瓶內(nèi)取出一大塊，用手分成2塊，再把2塊分成4塊，4塊 分成8塊，依次進(jìn)行。優(yōu)良菌種整塊多，碎渣少。劣次菌整塊少，碎渣多。
(5).液體菌種鑒別：當(dāng)三角瓶或發(fā)酵缸培養(yǎng)3-7天后，如液面出現(xiàn)氣泡，產(chǎn)生"油皮"、混濁等現(xiàn)象，說明菌種本 身帶有雜菌。如菌塊上浮，或遲遲長出很薄的菌絲層，則說明菌種生活力弱。白塊四周的菌絲生長快、濃白、棉絮狀，表明菌種生命力強(qiáng)。
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