大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在的地方，人畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。如果大腸菌群存在于食品中，表明食品未做有效的消毒處理、加工后保存條件不良或消毒又受到污染?？焖贆z驗大腸菌群，有助于食品的衛(wèi)生管理，維護(hù)消費者的健康安全。本文探討大腸菌群快速檢測技術(shù)及其在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生檢測中的應(yīng)用。
1 乳糖膽鹽發(fā)酵法
1.1實驗原理
大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭式陰性無芽孢桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌包括：大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量[1]，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。
1.2 實驗前準(zhǔn)備
1.2.1 檢驗樣品
食糖、糖果、飲料、蜂蜜、餅干、果凍、飲用水等7類食品共381份
1.2.2 培養(yǎng)基和試劑
冰箱：0℃～4℃；恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；恒溫水浴鍋：46℃±1℃；顯微鏡：10﹡～100﹡；均質(zhì)器或滅菌乳缽；架盤藥物天平：0g—500g，精確至0.59；滅菌吸管1ml（具0.01L刻度）；100ml（具0.1ml刻度）；滅菌錐形瓶：500mLo；滅菌玻璃珠：直徑約5mm；滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；滅菌試管：16mm或160mm；滅菌刀、剪子、鑷子等
1.2.3培養(yǎng)基和試劑
乳糖膽鹽發(fā)酵管；伊紅美藍(lán)瓊脂平板；乳糖發(fā)酵管；EC肉湯；磷酸鹽緩沖液；0.85%滅菌生理鹽水；革蘭氏染色液
1.3 實驗方法步驟
1.3.1 檢樣稀釋
以無菌操作將檢樣25 （mL）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好用滅菌均質(zhì)器，以8 000r/min～10 000r/min的速度處理1min，做成l：10的均勻稀釋液。
用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注人含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1：100的稀釋液。
另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做l0倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管.
1.3.2 乳糖發(fā)酵試驗
根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種三管。乳糖發(fā)酵試驗將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)醉管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36℃ 士1℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h士2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。
1.3.3分離培養(yǎng)
將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃ 土1℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h～24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。
1.3.4證實試驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1個一2個進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為革蘭式陰性無芽孢桿菌，挑取該菌落的另一部分，接種乳糖復(fù)發(fā)酵管，置36℃ 士1℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h士2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。
2結(jié)果
采用乳糖膽鹽發(fā)酵法測定和最可能數(shù)（MPN）法，對食糖、糖果、飲料、蜂蜜、餅干、果凍、飲用水等7種食品381份樣品進(jìn)行大腸菌群檢測，結(jié)果顯示：檢驗合格的樣品均為330份，兩種方法對樣品檢驗的合格率相同，均為86.6%，兩者合格符合率100%；兩種方法對大腸菌群的檢測結(jié)果相符的有365份，符合率95.8%；不合格的51份樣品有16份的結(jié)果略有不同，占所有樣品的4.2%。
3討論
乳糖膽鹽發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群分解乳糖膽鹽中的乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并且使伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基中伊紅與美藍(lán)結(jié)合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，在實際工作中，熟悉大腸菌群菌落特征色澤和形態(tài)，對檢出率影響很大。為了避免假陰性的判斷，通常需要多挑菌落，只挑取一個菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)[2]。判斷受影響的因素比較多，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性，因而造成工作量加大。并且一般來說，產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但隨樣品種類而有不同，有米粒大小氣泡也有陽性檢出。對未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可以用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡上浮，即應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)生，做進(jìn)一步實驗觀察。正中情況的陽性檢出率可達(dá)半數(shù)以上。對可疑菌落的選擇和判斷非常重要，因此這種檢驗方法對檢驗人員的操作經(jīng)驗和熟練程度要求比較嚴(yán)格。