中成藥微生物限度檢查法中細(xì)菌霉菌（酵母菌）計(jì)數(shù)的方法驗(yàn)證
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-02-13 09:25:42
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按中國(guó)藥典2005版有關(guān)規(guī)定，通過測(cè)定試驗(yàn)菌回收率建立4種中成藥的微生物限度檢查方法。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種藥均有一定程度的抑菌作用，但可通過培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌作用。確定4種藥的微生物限度檢查法中細(xì)菌計(jì)數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行檢測(cè)，霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法即可。
復(fù)方槐米膠囊、復(fù)方女貞子膠囊、復(fù)方苦參膠囊、復(fù)方香附膠囊等制劑處方中含有的多味中藥材具有抑菌活性成分，可抑制污染微生物的生長(zhǎng)，采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證，可消除其對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制。
1 試驗(yàn)材料
1.1 樣品
復(fù)方槐米膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號(hào)：050904；復(fù)方女貞子膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號(hào)：050902；復(fù)方苦參膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號(hào)：050903；復(fù)方香附膠囊，規(guī)格：每粒0.4g,批號(hào)：050901。以上樣品的供樣單位、生產(chǎn)單位均為66055部隊(duì)醫(yī)院。
1.2 培養(yǎng)基
改良馬丁培養(yǎng)基，批號(hào)050822；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號(hào)020918；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)050808；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)050905；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)020402。以上培養(yǎng)基均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。
1.3 稀釋劑
pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液，批號(hào)050917，生產(chǎn)單位：北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液自制。
1.4 試驗(yàn)用菌種
金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；以上菌種均來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。
2 試驗(yàn)方法
2.1 菌液的制備
金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌35℃培養(yǎng)18～24h后分別用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10－6、10-7、10-5；白色念珠菌25℃培養(yǎng)24～48h后用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10-3；黑曲霉25～28℃培養(yǎng)1周后，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液3mL洗下孢子，比濁后，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10-4備用。
2.2 供試液的制備
取樣品10g，置滅菌錐形瓶中，加入pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，置45℃的水浴振蕩器中，混勻，作為1：10供試液備用。
2.3 細(xì)菌
霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。試驗(yàn)組：取1:10供試液1mL、50～100cfu試驗(yàn)菌依次加入平皿中，立即傾注相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基20mL，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，待凝固后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h逐日觀察結(jié)果。樣品對(duì)照組：取規(guī)定量1:10供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定樣品本底菌數(shù)。
離心法為取1:10供試液，取液適量，以500r／min，離心5min，取上清液1mL進(jìn)行試驗(yàn)，其它試驗(yàn)過程同上
采用培養(yǎng)基稀釋法時(shí)，取離心后的上清液1mL按設(shè)計(jì)濃度分別平均注入幾個(gè)平皿中，其它試驗(yàn)過程同上，同法重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果見表1。
試驗(yàn)組的菌回收率(％)=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)一樣品對(duì)照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100％
3 討論
試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)4種中成藥的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)方法驗(yàn)證，均對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌3株陽(yáng)性代表菌株有抑制作用，回收率均未達(dá)到70％，而改用離心法(500r／min，離心5min)，棄去不溶性藥渣，取上清液進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌2株陽(yáng)性代表菌株回收率均達(dá)到70％以上，采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:400的濃度(即1:10的供試液0.5mL／Ⅲ)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，只有復(fù)方女貞子膠囊的枯草芽孢桿菌回收率未達(dá)到70％，采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:1000的濃度(即1:10的供試液0.2mL／Ⅲ)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可消除復(fù)方女貞子膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌活性，4種中成藥對(duì)白色念珠菌和黑曲霉無(wú)抗菌活性，按常規(guī)方法驗(yàn)證，回收率均達(dá)到70％以上。
經(jīng)驗(yàn)證確定復(fù)方槐米膠囊、復(fù)方苦參膠囊、復(fù)方香附膠囊、細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:400的濃度(即1:10的供試液0.5mL／Ⅲ)進(jìn)行檢測(cè)，復(fù)方女貞子膠囊細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:1000的濃度(即1:10的供試液0.2mL／Ⅲ)進(jìn)行檢測(cè)，4種中成藥霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)方法檢測(cè)。
本試驗(yàn)采用了離心加不同濃度的培養(yǎng)基稀釋法，解決了藥品中抑菌物質(zhì)的干擾問題，該法操作簡(jiǎn)單，能真實(shí)、準(zhǔn)確、有效地反映藥品中污染存活的細(xì)菌數(shù)，檢出率高。
本試驗(yàn)采用了離心加不同濃度的培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行微生物限度檢查中細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，其陽(yáng)性菌回收率均高于70％，符合中華人民共和國(guó)藥典2005版一部有關(guān)微生物限度檢查方法驗(yàn)證的規(guī)定要求。
采用本方法進(jìn)行離心時(shí)，要按規(guī)定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間進(jìn)行操作，不可任意改變條件，當(dāng)菌液與藥品液加入平皿后應(yīng)迅速倒入培養(yǎng)基。