中成藥微生物限度檢查法中細菌霉菌（酵母菌）計數(shù)的方法驗證
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-02-13 09:25:42
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按中國藥典2005版有關(guān)規(guī)定，通過測定試驗菌回收率建立4種中成藥的微生物限度檢查方法。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)4種藥均有一定程度的抑菌作用，但可通過培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌作用。確定4種藥的微生物限度檢查法中細菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法進行檢測，霉菌、酵母菌計數(shù)采用常規(guī)法即可。
復方槐米膠囊、復方女貞子膠囊、復方苦參膠囊、復方香附膠囊等制劑處方中含有的多味中藥材具有抑菌活性成分，可抑制污染微生物的生長，采用培養(yǎng)基稀釋法進行驗證，可消除其對微生物生長的抑制。
1 試驗材料
1.1 樣品
復方槐米膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號：050904；復方女貞子膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號：050902；復方苦參膠囊，規(guī)格：每粒0.4g，批號：050903；復方香附膠囊，規(guī)格：每粒0.4g,批號：050901。以上樣品的供樣單位、生產(chǎn)單位均為66055部隊醫(yī)院。
1.2 培養(yǎng)基
改良馬丁培養(yǎng)基，批號050822；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號020918；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，批號050808；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號050905；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號020402。以上培養(yǎng)基均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。
1.3 稀釋劑
pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液，批號050917，生產(chǎn)單位：北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；0.9％無菌氯化鈉溶液自制。
1.4 試驗用菌種
金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌[CMCC(B)44102]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；以上菌種均來自中國藥品生物制品檢定所。
2 試驗方法
2.1 菌液的制備
金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌35℃培養(yǎng)18～24h后分別用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至10－6、10-7、10-5；白色念珠菌25℃培養(yǎng)24～48h后用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至10-3；黑曲霉25～28℃培養(yǎng)1周后，用0.9％無菌氯化鈉溶液3mL洗下孢子，比濁后，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至10-4備用。
2.2 供試液的制備
取樣品10g，置滅菌錐形瓶中，加入pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液至100mL，置45℃的水浴振蕩器中，混勻，作為1：10供試液備用。
2.3 細菌
霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。試驗組：取1:10供試液1mL、50～100cfu試驗菌依次加入平皿中，立即傾注相應瓊脂培養(yǎng)基20mL，每株試驗菌平行制備2個平皿，待凝固后，按規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h逐日觀察結(jié)果。樣品對照組：取規(guī)定量1:10供試液，按菌落計數(shù)方法測定樣品本底菌數(shù)。
離心法為取1:10供試液，取液適量，以500r／min，離心5min，取上清液1mL進行試驗，其它試驗過程同上
采用培養(yǎng)基稀釋法時，取離心后的上清液1mL按設(shè)計濃度分別平均注入幾個平皿中，其它試驗過程同上，同法重復試驗3次，結(jié)果見表1。
試驗組的菌回收率(％)=(試驗組的平均菌落數(shù)一樣品對照組的平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)×100％
3 討論
試驗結(jié)果表明，對4種中成藥的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法采用常規(guī)方法驗證，均對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌3株陽性代表菌株有抑制作用，回收率均未達到70％，而改用離心法(500r／min，離心5min)，棄去不溶性藥渣，取上清液進行驗證試驗，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌2株陽性代表菌株回收率均達到70％以上，采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:400的濃度(即1:10的供試液0.5mL／Ⅲ)進行驗證試驗，只有復方女貞子膠囊的枯草芽孢桿菌回收率未達到70％，采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:1000的濃度(即1:10的供試液0.2mL／Ⅲ)進行驗證試驗，可消除復方女貞子膠囊對枯草芽孢桿菌抑菌活性，4種中成藥對白色念珠菌和黑曲霉無抗菌活性，按常規(guī)方法驗證，回收率均達到70％以上。
經(jīng)驗證確定復方槐米膠囊、復方苦參膠囊、復方香附膠囊、細菌計數(shù)可采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:400的濃度(即1:10的供試液0.5mL／Ⅲ)進行檢測，復方女貞子膠囊細菌計數(shù)可采用離心加培養(yǎng)基稀釋法1:1000的濃度(即1:10的供試液0.2mL／Ⅲ)進行檢測，4種中成藥霉菌及酵母菌計數(shù)采用常規(guī)方法檢測。
本試驗采用了離心加不同濃度的培養(yǎng)基稀釋法，解決了藥品中抑菌物質(zhì)的干擾問題，該法操作簡單，能真實、準確、有效地反映藥品中污染存活的細菌數(shù)，檢出率高。
本試驗采用了離心加不同濃度的培養(yǎng)基稀釋法進行微生物限度檢查中細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)，其陽性菌回收率均高于70％，符合中華人民共和國藥典2005版一部有關(guān)微生物限度檢查方法驗證的規(guī)定要求。
采用本方法進行離心時，要按規(guī)定的轉(zhuǎn)速和時間進行操作，不可任意改變條件，當菌液與藥品液加入平皿后應迅速倒入培養(yǎng)基。