大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，它大量存在于人及其他恒溫動物體內的腸道內，常隨人及動物糞便塊排出，會對水源造成污染。若在水和食品中檢出，可認為是被糞便污染的指標。
目前，世界各國及國際組織都將大腸菌群數作為重要環(huán)境衛(wèi)生學指標，并對其提出了嚴格的限制。中華人民共和國國家標準《生活飲用水水質衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群及糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出。
O157型大腸桿菌是20世紀70年代后期發(fā)現的新型傳染病，能引起人的出血性腹瀉和腸炎，且并發(fā)溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等，嚴重的可致人死亡。
檢測方法簡介
檢測大腸桿菌的傳統(tǒng)方法包括多管發(fā)酵法和濾膜法。
1.多管發(fā)酵法
大腸桿菌多管發(fā)酵法是指多管發(fā)酵法大腸菌群陽性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上以44.5℃培養(yǎng)24h，能產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產物，使培養(yǎng)基在紫外光下產生特征性熒光，以此來檢測水中大腸桿菌的方法。多管發(fā)酵法是對樣品中活菌濃度的一種估計值。
多管發(fā)酵法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測的食品。比如水、乳制品及其他食品中大腸菌群的計數測定。在對一個產氣腸桿菌純培養(yǎng)物作計數時，應采用選擇性平板計數法而不要采用多管發(fā)酵法。如果待檢測的樣品是以其他細菌為主的河水，就應選用多管發(fā)酵法。
2.濾膜法
濾膜法是指用孔徑為0.45pm的微孔濾膜過濾水樣，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，以37℃培養(yǎng)24h，形成特征性菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌以檢測水中大腸菌群的方法。采用濾膜過濾器過濾水樣，將水中含有的細菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在品紅硫酸鈉培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，因大腸菌群可以發(fā)酵乳糖，在濾膜上出現紫紅色具有金屬光澤的菌落。直接計數濾膜上生長的典型大腸菌群菌落，可計算出每升水樣中含有的大腸菌群數。如果有必要，對可疑菌落應進行涂片染色鏡檢，并再接種乳糖發(fā)酵管進一步鑒定。
濾膜法具有高度的再現性，可用于檢驗體積較大的水樣，能比多管發(fā)酵技術更快地獲得肯定的結果。不過在檢驗渾濁度高、非大腸桿菌類的細菌密度大的水樣時，有其局限性。
目前，國內外研究人員已經應用了一些新方法進行大腸桿菌的快速檢測，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應技術、免疫分析法、電化學方法、熒光法等。
3.酶底物法
在GBT5750.12-2006生活飲用水標準檢驗方法中介紹了大腸菌群和大腸桿菌酶底物法。大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產生β-半乳糖昔酶（β-D-galactosidase）的細菌群組，該細菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現顏色變化，以此技術來檢測水中總大腸菌群的方法。大腸桿菌酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產生P-半乳糖昔酶（β-Dgalactosidase）分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現顏色變化，并能產生壓葡萄糖醛酸酶（β-ghicuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產物，使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光，以此技術來檢測大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。
酶底物法之所以可以入選國家標準，是由于幾乎所有的大腸菌群都有β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase）活性，94%～97%的大腸桿菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶（β-Dglucuronidase）活性，而且水體和食品中都缺少這兩種酶。因此，基于這兩種酶的水體和食品中大腸菌群及大腸桿菌的檢測方法得到了迅速的發(fā)展。
4.聚合酶鏈反應技術
聚合酶鏈反應技術（PCR.Polymerase Chain Reaction）是利用從耐熱菌中分離的DNA聚合酶，加入適量寡聚核普酸引物，以4種脫氧核普酸材料模擬天然DNA復制過程，在實驗室條件下特異性擴增DNA（或RNA）片段的一種新技術。
PCR技術經過近20年的發(fā)展已經相當標準和成熟，與電化學傳感器、酶聯(lián)免疫分析及表面等離子共振傳感器等檢測方法結合，已被廣泛應用于細菌的檢測，成為微生物檢測技術中常見而重要的最基礎的分析手段之一。
PCR技術檢測大腸桿菌有3點局限：一是難以精確定量；二是由于靈敏度高，操作不慎易交叉污染，產生假陽性，三是操作復雜，儀器昂貴，不利于大規(guī)模應用。
5.免疫分析法
免疫檢測技術是基于抗體與抗原或半抗原之問的高選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法，分為放射免疫分析、熒光免疫分析、化學發(fā)光免疫分析、酶免疫分析、酶聯(lián)免疫分析及電化學免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。
免疫檢測技術具有許多優(yōu)點：第一，高選擇性。抗體的特異性很高，在免疫分析中一般樣品不需要預處理，這一點決定了分析結果的可靠性，同時可以省略預分離的過程。第二，高親和性。保證分析數據的精密度和分析結果的準確性，這也是達到高靈敏分析的基礎。事實上，抗體與抗原復合物的穩(wěn)定常數一般為109，有些可達1014-1015，有較高的穩(wěn)定性。第三，高靈敏性?？贵w與其復合物間應有較大的信號反差，試劑空白低，從而結果準確而靈敏。免疫檢測技術還具有檢測時間短、樣品通量大、檢測成本低等優(yōu)勢。因此，在水體和食品中大腸桿菌的檢測領域得到了諸多應用。
6.化學發(fā)光法
化學發(fā)光法是利用物質在進行化學反應過程中伴隨的光輻射現象的一種化學分析方法。化學發(fā)光法在培養(yǎng)時間足夠長的情況下可以檢測到非常低的細菌濃度，最低可以準確檢測到樣品中的幾個大腸桿菌。由于對細菌的滲透可以減胞內酶的擴散障礙，加速基底向酶的傳遞，科學工作者經常利用此來提高檢測號。
除了上述的方法外，還有許多快速檢測方法，如納米裝置、熒光分析結合免疫技術等方法，以及商業(yè)化的快速檢測方法包括特異性檢驗的培養(yǎng)基、檢測試紙片等。 以上快速檢測方法很少單獨使用，更多情況下是多個方法復合使用，以提高檢測準確性，縮短檢測時間。但是這些方法還有許多方面需要改進，其各自的不足限制了檢測方法的推廣和運用；而且隨著對大腸桿菌的檢測速度和精確度要求的不斷提高，需要建立更有效的方法，為人們的生活環(huán)境及安全提供有力的保障。
快速檢測膠體金方法
這是一種簡單快捷的腸出血性大腸桿菌檢測方法，旨在制備出高靈敏度腸出血性大腸桿菌膠體金試紙條，直接檢測樣品中的腸出血性大腸桿菌，解決了長期存在的腸出血性大腸桿菌檢測周期長，檢測操作復雜的難題；此外，本發(fā)明采用的免疫膠體金層析分析法，納米膠體金技術結合免疫原理，檢測方法操作簡單、方便快捷、準確靈敏，適合現場快速檢測，利于檢測部門的監(jiān)控。
需要制備的材料：免疫抗原的制備：免疫小鼠：抗體的純化：膠體金試紙條的制備。
免疫抗原的制備：將二代腸出血性大腸桿菌菌株制備成菌懸液。
免疫小鼠：選用6～8周的BaIB/c小鼠，初次免疫菌懸液與弗氏完全佐劑混合，乳化完全，皮下多點注射，1m L/每只，每隔兩周，用相同劑量的菌懸液與弗氏不完全佐劑進行加強免疫，共加強免疫兩次，最后次免疫后8—10天小鼠尾部取血，通過間接ELISA測抗體血清效價，則進行小鼠眼部取血。
抗體的純化：將血清置于Protein G親和層析柱（KPL）吸附瓊脂的表面，用10倍柱體積1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱體積的1×ElutionBuffer洗脫，得到腸出血性大腸桿菌特異性抗體。
1.膠體金試紙條制備的具體步驟
?。?）膠體金的制備：利用冷凝回流裝置將50mL質量分數為0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰后迅速加入質量分數為1%的檸檬酸三鈉溶液1.2mL，待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸10min，冷卻，4℃保存?zhèn)溆茫猛渡潆婄R和紫外光譜掃描儀分析膠體金的性狀。
（2）標記條件的選擇：在酶標板孔中分別加入膠體金100μL，而后依次從少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的腸出血性大腸桿菌特異性抗體，混勻10min后備加入10%NaCl溶液20μL，于10min后肉眼觀察反應結果。第一個保持不變顏色的孔的抗PBP2a單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn)定量，最少穩(wěn)定量增加10%左右為實際標記量，取3支1.5mL離心管各裝膠體金1mL，用0.1mol/L HCI和K2CO3分別調pH為7.2、8.2、9.2，加入最佳標記抗體量，對比標記效果。
?。?）免疫膠體金制備：取10mL膠體金于三角瓶中，用K2CO3調pH為最佳標記條件，加入最佳標記抗體量，RT攪拌反應30min，得免疫膠體金，8000rpm離心30min，用1mL PBS復溶免疫膠體金備用，將制備好的免疫膠體金噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金墊。
（4）層析NC膜的制備：將羊抗鼠二抗（C線）和腸出血性大腸桿菌多克隆抗體（T線）分別劃在NC膜上，制成層析NC膜。
（5）紙條的組裝：取一張PVC底板，在離上方18mm處貼上20mm寬的硝酸纖維膜，上方貼上19mm寬的吸水紙，壓上硝酸纖維膜1mm，硝酸纖維膜下方貼上結合墊，結合墊壓硝酸纖維膜1mm，膠體金墊下面貼上玻璃纖維膜，壓上膠體金墊3mm，下端與底板對齊，見圖1。
2.大腸桿菌O157快速檢測試劑盒
（1）檢測原理
本品采用鼠抗大腸桿菌特異性單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別包被硝酸纖維素膜作為檢測線和質控線，膠體金標記的兔抗大腸桿菌抗體及其他試劑組成。應用層析式雙抗體夾心原理定性檢測樣本中的大腸桿菌O157。
（2）檢測范圍
肉類、豆制品、海產品，冷飲。
?。?）技術指標
檢測下限：1×103CFU/mL。
?。?）檢測步驟
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加4mL無菌生理鹽水于5mL裝有增菌培養(yǎng)基的離心管中，振搖，使培養(yǎng)基充分溶解，無菌稱取剪碎（剪刀滅菌）的樣品（固態(tài)）0.5g（液態(tài)0.5mL），加入增菌培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕4-6h，上清為樣品檢測液，待檢。
?、跇悠窓z測：
從原包裝袋中取出檢測卡，水平放置于觀察者正面，做好編號標記（打開后請立即使用）。
用包裝內所附無菌吸管吸取樣品檢測液，滴加3滴（約90μL）于加樣孔中。加樣后開始計時，結果應在5～10分鐘內讀取，其他時間判斷結果僅供參考。
（5）結果判斷
結果判斷見圖2。
陰性（-）：T線不顯色，表示樣品中不含大腸桿菌O157或大腸桿菌O157含量低于1×103CFU/mL：
陽性（+）：T線與C線同時出現，表示樣品中大腸桿菌O157含量等于或高于1×103CFU/mL；
無效：C線未出現或兩條線都不出現，表示前處理操作有誤或檢測卡已變質失效。在此情況下，應再次仔細閱讀說明書，并重新試驗。
?。?）注意事項
在環(huán)境溫度20～30℃下操作；檢測卡極易受潮，打開小包裝后應立即使用；
本產品在4-30℃密封干燥保存；忌冷凍：檢測卡保存期1年：
操作的原則是不能污染待檢樣品，所有跟待檢樣品接觸的器具都應滅菌，或一次性滅菌器具，操作人員應戴口罩，無菌手套。