大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，它大量存在于人及其他恒溫動(dòng)物體內(nèi)的腸道內(nèi)，常隨人及動(dòng)物糞便塊排出，會(huì)對(duì)水源造成污染。若在水和食品中檢出，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)。
目前，世界各國(guó)及國(guó)際組織都將大腸菌群數(shù)作為重要環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，并對(duì)其提出了嚴(yán)格的限制。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群及糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出。
O157型大腸桿菌是20世紀(jì)70年代后期發(fā)現(xiàn)的新型傳染病，能引起人的出血性腹瀉和腸炎，且并發(fā)溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等，嚴(yán)重的可致人死亡。
檢測(cè)方法簡(jiǎn)介
檢測(cè)大腸桿菌的傳統(tǒng)方法包括多管發(fā)酵法和濾膜法。
1.多管發(fā)酵法
大腸桿菌多管發(fā)酵法是指多管發(fā)酵法大腸菌群陽(yáng)性，在含有熒光底物的培養(yǎng)基上以44.5℃培養(yǎng)24h，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使培養(yǎng)基在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此來(lái)檢測(cè)水中大腸桿菌的方法。多管發(fā)酵法是對(duì)樣品中活菌濃度的一種估計(jì)值。
多管發(fā)酵法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測(cè)的食品。比如水、乳制品及其他食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)測(cè)定。在對(duì)一個(gè)產(chǎn)氣腸桿菌純培養(yǎng)物作計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)采用選擇性平板計(jì)數(shù)法而不要采用多管發(fā)酵法。如果待檢測(cè)的樣品是以其他細(xì)菌為主的河水，就應(yīng)選用多管發(fā)酵法。
2.濾膜法
濾膜法是指用孔徑為0.45pm的微孔濾膜過(guò)濾水樣，將濾膜貼在添加乳糖的選擇性培養(yǎng)基上，以37℃培養(yǎng)24h，形成特征性菌落的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌以檢測(cè)水中大腸菌群的方法。采用濾膜過(guò)濾器過(guò)濾水樣，將水中含有的細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜放在品紅硫酸鈉培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，因大腸菌群可以發(fā)酵乳糖，在濾膜上出現(xiàn)紫紅色具有金屬光澤的菌落。直接計(jì)數(shù)濾膜上生長(zhǎng)的典型大腸菌群菌落，可計(jì)算出每升水樣中含有的大腸菌群數(shù)。如果有必要，對(duì)可疑菌落應(yīng)進(jìn)行涂片染色鏡檢，并再接種乳糖發(fā)酵管進(jìn)一步鑒定。
濾膜法具有高度的再現(xiàn)性，可用于檢驗(yàn)體積較大的水樣，能比多管發(fā)酵技術(shù)更快地獲得肯定的結(jié)果。不過(guò)在檢驗(yàn)渾濁度高、非大腸桿菌類的細(xì)菌密度大的水樣時(shí)，有其局限性。
目前，國(guó)內(nèi)外研究人員已經(jīng)應(yīng)用了一些新方法進(jìn)行大腸桿菌的快速檢測(cè)，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、免疫分析法、電化學(xué)方法、熒光法等。
3.酶底物法
在GBT5750.12-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中介紹了大腸菌群和大腸桿菌酶底物法。大腸菌群酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生β-半乳糖昔酶（β-D-galactosidase）的細(xì)菌群組，該細(xì)菌群組能分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，以此技術(shù)來(lái)檢測(cè)水中總大腸菌群的方法。大腸桿菌酶底物法是指在選擇性培養(yǎng)基上能產(chǎn)生P-半乳糖昔酶（β-Dgalactosidase）分解色原底物釋放出色原體使培養(yǎng)基呈現(xiàn)顏色變化，并能產(chǎn)生壓葡萄糖醛酸酶（β-ghicuronidase）分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物，使菌落能夠在紫外光下產(chǎn)生特征性熒光，以此技術(shù)來(lái)檢測(cè)大腸埃希氏菌的方法為大腸埃希氏菌酶底物法。
酶底物法之所以可以入選國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，是由于幾乎所有的大腸菌群都有β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase）活性，94%～97%的大腸桿菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶（β-Dglucuronidase）活性，而且水體和食品中都缺少這兩種酶。因此，基于這兩種酶的水體和食品中大腸菌群及大腸桿菌的檢測(cè)方法得到了迅速的發(fā)展。
4.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)
聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR.Polymerase Chain Reaction）是利用從耐熱菌中分離的DNA聚合酶，加入適量寡聚核普酸引物，以4種脫氧核普酸材料模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程，在實(shí)驗(yàn)室條件下特異性擴(kuò)增DNA（或RNA）片段的一種新技術(shù)。
PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)和成熟，與電化學(xué)傳感器、酶聯(lián)免疫分析及表面等離子共振傳感器等檢測(cè)方法結(jié)合，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)，成為微生物檢測(cè)技術(shù)中常見(jiàn)而重要的最基礎(chǔ)的分析手段之一。
PCR技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌有3點(diǎn)局限：一是難以精確定量；二是由于靈敏度高，操作不慎易交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性，三是操作復(fù)雜，儀器昂貴，不利于大規(guī)模應(yīng)用。
5.免疫分析法
免疫檢測(cè)技術(shù)是基于抗體與抗原或半抗原之問(wèn)的高選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一種生物化學(xué)分析法，分為放射免疫分析、熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶免疫分析、酶聯(lián)免疫分析及電化學(xué)免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。
免疫檢測(cè)技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)：第一，高選擇性?？贵w的特異性很高，在免疫分析中一般樣品不需要預(yù)處理，這一點(diǎn)決定了分析結(jié)果的可靠性，同時(shí)可以省略預(yù)分離的過(guò)程。第二，高親和性。保證分析數(shù)據(jù)的精密度和分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這也是達(dá)到高靈敏分析的基礎(chǔ)。事實(shí)上，抗體與抗原復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù)一般為109，有些可達(dá)1014-1015，有較高的穩(wěn)定性。第三，高靈敏性?？贵w與其復(fù)合物間應(yīng)有較大的信號(hào)反差，試劑空白低，從而結(jié)果準(zhǔn)確而靈敏。免疫檢測(cè)技術(shù)還具有檢測(cè)時(shí)間短、樣品通量大、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)。因此，在水體和食品中大腸桿菌的檢測(cè)領(lǐng)域得到了諸多應(yīng)用。
6.化學(xué)發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光法是利用物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中伴隨的光輻射現(xiàn)象的一種化學(xué)分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光法在培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)的情況下可以檢測(cè)到非常低的細(xì)菌濃度，最低可以準(zhǔn)確檢測(cè)到樣品中的幾個(gè)大腸桿菌。由于對(duì)細(xì)菌的滲透可以減胞內(nèi)酶的擴(kuò)散障礙，加速基底向酶的傳遞，科學(xué)工作者經(jīng)常利用此來(lái)提高檢測(cè)號(hào)。
除了上述的方法外，還有許多快速檢測(cè)方法，如納米裝置、熒光分析結(jié)合免疫技術(shù)等方法，以及商業(yè)化的快速檢測(cè)方法包括特異性檢驗(yàn)的培養(yǎng)基、檢測(cè)試紙片等。 以上快速檢測(cè)方法很少單獨(dú)使用，更多情況下是多個(gè)方法復(fù)合使用，以提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，縮短檢測(cè)時(shí)間。但是這些方法還有許多方面需要改進(jìn)，其各自的不足限制了檢測(cè)方法的推廣和運(yùn)用；而且隨著對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)速度和精確度要求的不斷提高，需要建立更有效的方法，為人們的生活環(huán)境及安全提供有力的保障。
快速檢測(cè)膠體金方法
這是一種簡(jiǎn)單快捷的腸出血性大腸桿菌檢測(cè)方法，旨在制備出高靈敏度腸出血性大腸桿菌膠體金試紙條，直接檢測(cè)樣品中的腸出血性大腸桿菌，解決了長(zhǎng)期存在的腸出血性大腸桿菌檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)操作復(fù)雜的難題；此外，本發(fā)明采用的免疫膠體金層析分析法，納米膠體金技術(shù)結(jié)合免疫原理，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、方便快捷、準(zhǔn)確靈敏，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，利于檢測(cè)部門的監(jiān)控。
需要制備的材料：免疫抗原的制備：免疫小鼠：抗體的純化：膠體金試紙條的制備。
免疫抗原的制備：將二代腸出血性大腸桿菌菌株制備成菌懸液。
免疫小鼠：選用6～8周的BaIB/c小鼠，初次免疫菌懸液與弗氏完全佐劑混合，乳化完全，皮下多點(diǎn)注射，1m L/每只，每隔兩周，用相同劑量的菌懸液與弗氏不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫兩次，最后次免疫后8—10天小鼠尾部取血，通過(guò)間接ELISA測(cè)抗體血清效價(jià)，則進(jìn)行小鼠眼部取血。
抗體的純化：將血清置于Protein G親和層析柱（KPL）吸附瓊脂的表面，用10倍柱體積1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱體積的1×ElutionBuffer洗脫，得到腸出血性大腸桿菌特異性抗體。
1.膠體金試紙條制備的具體步驟
?。?）膠體金的制備：利用冷凝回流裝置將50mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰后迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液1.2mL，待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)煮沸10min，冷卻，4℃保存?zhèn)溆?，利用投射電鏡和紫外光譜掃描儀分析膠體金的性狀。
?。?）標(biāo)記條件的選擇：在酶標(biāo)板孔中分別加入膠體金100μL，而后依次從少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的腸出血性大腸桿菌特異性抗體，混勻10min后備加入10%NaCl溶液20μL，于10min后肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。第一個(gè)保持不變顏色的孔的抗PBP2a單克隆抗體加入量即為最少穩(wěn)定量，最少穩(wěn)定量增加10%左右為實(shí)際標(biāo)記量，取3支1.5mL離心管各裝膠體金1mL，用0.1mol/L HCI和K2CO3分別調(diào)pH為7.2、8.2、9.2，加入最佳標(biāo)記抗體量，對(duì)比標(biāo)記效果。
?。?）免疫膠體金制備：取10mL膠體金于三角瓶中，用K2CO3調(diào)pH為最佳標(biāo)記條件，加入最佳標(biāo)記抗體量，RT攪拌反應(yīng)30min，得免疫膠體金，8000rpm離心30min，用1mL PBS復(fù)溶免疫膠體金備用，將制備好的免疫膠體金噴涂在玻璃纖維膜上制成膠體金墊。
?。?）層析NC膜的制備：將羊抗鼠二抗（C線）和腸出血性大腸桿菌多克隆抗體（T線）分別劃在NC膜上，制成層析NC膜。
?。?）紙條的組裝：取一張PVC底板，在離上方18mm處貼上20mm寬的硝酸纖維膜，上方貼上19mm寬的吸水紙，壓上硝酸纖維膜1mm，硝酸纖維膜下方貼上結(jié)合墊，結(jié)合墊壓硝酸纖維膜1mm，膠體金墊下面貼上玻璃纖維膜，壓上膠體金墊3mm，下端與底板對(duì)齊，見(jiàn)圖1。
2.大腸桿菌O157快速檢測(cè)試劑盒
?。?）檢測(cè)原理
本品采用鼠抗大腸桿菌特異性單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別包被硝酸纖維素膜作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，膠體金標(biāo)記的兔抗大腸桿菌抗體及其他試劑組成。應(yīng)用層析式雙抗體夾心原理定性檢測(cè)樣本中的大腸桿菌O157。
（2）檢測(cè)范圍
肉類、豆制品、海產(chǎn)品，冷飲。
（3）技術(shù)指標(biāo)
檢測(cè)下限：1×103CFU/mL。
（4）檢測(cè)步驟
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加4mL無(wú)菌生理鹽水于5mL裝有增菌培養(yǎng)基的離心管中，振搖，使培養(yǎng)基充分溶解，無(wú)菌稱取剪碎（剪刀滅菌）的樣品（固態(tài)）0.5g（液態(tài)0.5mL），加入增菌培養(yǎng)基中，37℃恒溫恒濕4-6h，上清為樣品檢測(cè)液，待檢。
②樣品檢測(cè)：
從原包裝袋中取出檢測(cè)卡，水平放置于觀察者正面，做好編號(hào)標(biāo)記（打開(kāi)后請(qǐng)立即使用）。
用包裝內(nèi)所附無(wú)菌吸管吸取樣品檢測(cè)液，滴加3滴（約90μL）于加樣孔中。加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在5～10分鐘內(nèi)讀取，其他時(shí)間判斷結(jié)果僅供參考。
?。?）結(jié)果判斷
結(jié)果判斷見(jiàn)圖2。
陰性（-）：T線不顯色，表示樣品中不含大腸桿菌O157或大腸桿菌O157含量低于1×103CFU/mL：
陽(yáng)性（+）：T線與C線同時(shí)出現(xiàn)，表示樣品中大腸桿菌O157含量等于或高于1×103CFU/mL；
無(wú)效：C線未出現(xiàn)或兩條線都不出現(xiàn)，表示前處理操作有誤或檢測(cè)卡已變質(zhì)失效。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，并重新試驗(yàn)。
?。?）注意事項(xiàng)
在環(huán)境溫度20～30℃下操作；檢測(cè)卡極易受潮，打開(kāi)小包裝后應(yīng)立即使用；
本產(chǎn)品在4-30℃密封干燥保存；忌冷凍：檢測(cè)卡保存期1年：
操作的原則是不能污染待檢樣品，所有跟待檢樣品接觸的器具都應(yīng)滅菌，或一次性滅菌器具，操作人員應(yīng)戴口罩，無(wú)菌手套。