大多數(shù)微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用范圍最廣的微生物保存法。需要復雜營養(yǎng)的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低溫的方法保存（ATCC1983；Halliday，Baker1985）。此法是將凍存在小管或安瓿里的細胞以較慢的冷凍速率（1℃／分鐘）冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～－196℃的液氮中。
超低溫的冷凍保護劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC常用一種由甘油（10％）、二甲亞砜（5％）和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細胞株。這些化學試劑進入細胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷。貯存在低溫容器內(nèi)的細胞復蘇時必須小心操作。當小管被加熱時，所形成的冰晶會將細胞殺死，正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打開管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。
超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中，因此需要液氮罐。在長期貯存的過程中必須經(jīng)常注意補充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等。