酵母(saccharomyce) 是基因克隆實(shí)驗(yàn)中常用的真核生物受體細(xì)胞，培養(yǎng)酵母菌和培養(yǎng)大腸桿菌一樣方便。酵母克隆載體的種類(lèi)也很多。酵母菌也有質(zhì)粒存在，這種2pm 長(zhǎng)的質(zhì)粒稱(chēng)為2um 質(zhì)粒，約6 300bp。這種質(zhì)粒至少有一段時(shí)間存在于細(xì)胞核內(nèi)染色體以外，利用2pm 質(zhì)粒和大腸桿菌中的質(zhì)粒可以構(gòu)建成能穿梭于細(xì)菌與酵母菌細(xì)胞之間的穿梭質(zhì)粒。酵母克隆載體都是在這個(gè)基礎(chǔ)上構(gòu)建的。
酵母是一些單細(xì)胞真菌，并非系統(tǒng)演化分類(lèi)的單元。一種肉眼看不見(jiàn)的微小單細(xì)胞微生物，能將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，分布于整個(gè)自然界，是一種典型的兼性厭氧微生物，在有氧和無(wú)氧條件下都能夠存活，是一種天然發(fā)酵劑。一般泛指能發(fā)酵糖類(lèi)的各種單細(xì)胞真菌，可用于釀造生產(chǎn)，也可為致病菌——遺傳工程和細(xì)胞周期研究的模式生物。酵母菌是人類(lèi)文明史中被應(yīng)用得最早的微生物。目前已知有1000多種酵母，根據(jù)酵母菌產(chǎn)生孢子（子囊孢子和擔(dān)孢子）的能力，可將酵母分成三類(lèi)：形成孢子的株系屬于子囊菌和擔(dān)子菌。不形成孢子但主要通過(guò)出芽生殖來(lái)繁殖的稱(chēng)為不完全真菌，或者叫“假酵母”（類(lèi)酵母）。
一、材料、儀器與試劑
材料：酵母菌、酵母固態(tài)發(fā)酵酒醅、黃水等；
儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀、滅菌鍋、窖糧糟、錐形瓶、燒杯、接種針、接種環(huán)、移液槍等；
試劑：YPD培養(yǎng)基、糟醅浸汁液體培養(yǎng)基、蒸餾水等。
二、固態(tài)發(fā)酵步驟
（一）、酵母活化
1、將保存菌種的EP管取出，4℃冰箱中解凍2-3h。
2、用牛皮紙包好130個(gè)平板（每個(gè)包12個(gè)）、4支接種針、130支10mL試管，并將1000mL蒸餾水（洗脫酵母用，130*5=650mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)制備1000mL）分裝至4個(gè)500mL錐形瓶中，塞好棉花塞后，用牛皮紙包好，121℃滅菌20min，滅菌完成后移至超凈工作臺(tái)冷卻，備用。
3、配制YPD培養(yǎng)基（130株菌，共計(jì)130*30mL=3900mL，實(shí)驗(yàn)時(shí)制備4000mL備用）
（1）稱(chēng)取40g酵母膏, 80g蛋白胨于4000ml水中，加入80g瓊脂粉于電磁爐專(zhuān)用鍋（2個(gè)）中，加熱攪拌溶解，用鹽酸與氫氧化鈉溶液調(diào)pH為4.5，分裝至16個(gè)500mL錐形瓶中；
（2）塞好棉花塞后，用牛皮紙包好，121℃滅菌20min；
（3）滅菌完成后移至超凈工作臺(tái)冷卻至50℃-60℃，制備平板共計(jì)130個(gè)。
4、接種酵母，培養(yǎng)
（1）在超凈工作臺(tái)上，用接種針將EP管中的酵母挑取到制備好的平板上劃線（每株菌一個(gè)平板）；
（2）貼好標(biāo)簽后，移至恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)至形成肉眼可見(jiàn)的單菌落。
5、制備酵母菌懸液
（1）在超凈工作臺(tái)上，向平板中加入5mL先前制備好的無(wú)菌蒸餾水（條件允許時(shí)用酵母生理鹽水），用接種針挑動(dòng)，洗脫菌落，得酵母菌懸液；
（2）移至10mL試管中，塞好棉花塞后，貼好標(biāo)簽，備用。
（二）、實(shí)驗(yàn)設(shè)備轉(zhuǎn)移（實(shí)驗(yàn)室至生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)）
1.準(zhǔn)備約140個(gè)玻璃發(fā)酵壇（每株菌一個(gè)共130個(gè)，空白糟醅（未拌酒曲）一個(gè)、生產(chǎn)廠方發(fā)酵生產(chǎn)糟醅（加無(wú)菌水5%）一個(gè)、發(fā)酵完成但未蒸餾的糟醅一個(gè)、老師實(shí)驗(yàn)用2個(gè)、其它5個(gè)），裝箱；
2.準(zhǔn)備150雙塑料手套、一張約10平方米塑料紙、150張保鮮膜、10個(gè)50mL燒杯（拌黃水與菌種用）、4支玻璃棒，2-4壺開(kāi)水（在廠方接?。┑?；
3.將上述物品與制備好的酵母菌懸液（試管）一并用車(chē)帶至生產(chǎn)廠方，備用。
（三）、接種、拌和、封壇
1.將10平方米的塑料紙鋪開(kāi)，鏟取130*700=91000mL約130*500=65000g=65kg（實(shí)驗(yàn)時(shí)可相應(yīng)增加使用量）的糟醅（未拌酒曲）于塑料紙上；
2.分2-4組，拌和。每株菌用35mL黃水、700mL(500g)糟醅、5mL酵母菌懸液。
（1）用開(kāi)水將燒杯與玻璃棒滅菌，冷卻；
（2）移取700mL(500g)糟醅于一張保鮮膜上，將35mL黃水與5mL酵母菌懸液在燒杯中用玻璃棒拌勻后倒在糟醅上，帶上手套拌和均勻（每株菌用一雙手套、燒杯與玻璃棒拌菌后用開(kāi)水滅菌，冷卻）；
（3）將拌好菌的糟醅移至發(fā)酵壇中，壓至理想程度后，蓋上壇蓋，用細(xì)沙封口，貼好標(biāo)簽。
（4）將發(fā)酵壇轉(zhuǎn)車(chē)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室30℃恒溫培養(yǎng)30d（開(kāi)空調(diào)調(diào)溫），定期觀察記錄。
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