藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則！
小楊 / 2020-02-26 09:19:45
百歐博偉生物：本指導(dǎo)原則是為所采用的試驗(yàn)方法能否替代藥典規(guī)定的方法用于藥品微生物的檢驗(yàn)提供指導(dǎo)。
隨著微生物學(xué)的迅速發(fā)展，制藥領(lǐng)域不斷引入了一些新的微生物檢驗(yàn)技術(shù)，大體可分為三類：( l )基于微生物生長(zhǎng)信息的檢驗(yàn)技術(shù)，如生物發(fā)光技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、比濁法等；( 2 )直接測(cè)定被測(cè)介質(zhì)中活微生物的檢驗(yàn)技術(shù)，如固相細(xì)胞技術(shù)法、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法等；( 3 )基于微生物細(xì)胞所含有特定組成成分的分析技術(shù)，如脂肪酸測(cè)定技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、基因指紋分析技術(shù)等。這些方法與傳統(tǒng)檢查方法比較，或簡(jiǎn)便快速，或具有實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)監(jiān)控的潛力，使生產(chǎn)早期采取糾正措施及監(jiān)控和指導(dǎo)優(yōu)良生產(chǎn)成為可能，同時(shí)新技術(shù)的使用也促進(jìn)了生產(chǎn)成本降低及檢驗(yàn)水平的提高。
在控制藥品微生物質(zhì)量中，微生物實(shí)驗(yàn)室出于各種原因如成本、生產(chǎn)量、快速簡(jiǎn)便及提高藥品質(zhì)量等需要而采用非藥典規(guī)定的檢驗(yàn)方法（即替代方法）時(shí)，應(yīng)進(jìn)行替代方法的驗(yàn)證，確認(rèn)其應(yīng)川效果優(yōu)于或等同于藥典的方法。
一、微生物檢驗(yàn)的類型及驗(yàn)證參數(shù)
藥品微生物檢驗(yàn)方法主要分兩種類型：定性試驗(yàn)和定量試驗(yàn)。定性試驗(yàn)就是測(cè)定樣品中是否存在活的微生物，如無(wú)菌檢查及控制菌檢查。定量試驗(yàn)就是測(cè)定樣品中存在的微生物數(shù)量，如菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)。
由于生物試驗(yàn)的特殊性，如微生物檢驗(yàn)方法中的抽樣誤差、稀釋誤差、操作誤差、培養(yǎng)誤差和計(jì)數(shù)誤差都會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響，因此，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則（二部附錄XIX A ）不完全適宜于微生物替代方法的驗(yàn)證。藥品微生物檢驗(yàn)替代方法的驗(yàn)證參數(shù)見表l 。
表l 不同微生物檢驗(yàn)類型驗(yàn)證參數(shù)
注：＋表示需要驗(yàn)證的參數(shù)；－表示不需要驗(yàn)證的參數(shù)。
盡管替代方法的驗(yàn)證參數(shù)與藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證參數(shù)有相似之處，但是其具體的內(nèi)容是依據(jù)微生物檢驗(yàn)特點(diǎn)而設(shè)立的。替代方法驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)替代方法屬于定性檢驗(yàn)時(shí)，一般采用．非參數(shù)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)；當(dāng)替代方法屬于定量檢驗(yàn)時(shí)，需要采用參數(shù)統(tǒng)計(jì)技術(shù)。
進(jìn)行微生物替代方法的驗(yàn)證時(shí)，若替代方法只是針對(duì)藥典方法中的某一環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)修改，此時(shí)，需要驗(yàn)證的對(duì)象僅是該項(xiàng)替代技術(shù)而不是整個(gè)檢驗(yàn)方法。如無(wú)菌試驗(yàn)若改為使用含培養(yǎng)基的過(guò)濾器，然后通過(guò)適宜的技術(shù)確認(rèn)活的微生物存在，那么，驗(yàn)證時(shí)僅需驗(yàn)證所用的微生物回收系統(tǒng)而不是整個(gè)無(wú)菌試驗(yàn)方法。
二、替代方法驗(yàn)證的一般要求
在開展替代方法對(duì)樣品檢驗(yàn)的適用性驗(yàn)證前，有必要對(duì)替代方法有一個(gè)全面的了解。首先，所選用的替代方法應(yīng)具備必要的方法適用性證據(jù)，表明在不含樣品的情況下，替代方法在不同類型的微生物檢驗(yàn)中所具有的專屬性、精密度和檢測(cè)限等參數(shù)。這些證據(jù)或由替代方法的研發(fā)者提供，或由方法使用者完成。
使用者在基本確認(rèn)替代方法的適用性后，應(yīng)采用樣品按表l 規(guī)定的參數(shù)逐一進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)替代方法可否用于該樣品的檢驗(yàn)。驗(yàn)證至少使用2 個(gè)批號(hào)的樣品，每批樣品應(yīng)平行進(jìn)行至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
在開展各參數(shù)驗(yàn)證時(shí)，涉及的菌種除應(yīng)包括微生物限度檢夜法（附錄XII G ）和無(wú)菌檢查法（附錄XII A）中培養(yǎng)基適用性檢查規(guī)定的菌株外，還應(yīng)根據(jù)替代方法及樣品的特點(diǎn)增加相應(yīng)的菌株。各菌種應(yīng)分別進(jìn)行驗(yàn)證。
三、樣品中微生物定性檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證
1、專屬性
微生物定性檢驗(yàn)的專屬性是指檢測(cè)樣品中可能存在的特定微生物種類的能力。當(dāng)替代方法以微生物生長(zhǎng)作為判斷微生物是否存在時(shí)，其專屬性驗(yàn)證應(yīng)確認(rèn)所用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)試驗(yàn)，還應(yīng)考慮樣品的存在對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。當(dāng)替代方法不是以微生物生長(zhǎng)作為判斷指標(biāo)時(shí)，其專屬性驗(yàn)證應(yīng)確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)中的外來(lái)成分不得干擾試驗(yàn)而影響結(jié)果，如確認(rèn)樣品的存在不會(huì)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果造成影響。采用替代方法進(jìn)行控制菌的檢驗(yàn)，還應(yīng)選擇與控制菌具有類似特性的菌株作為驗(yàn)證對(duì)象。
2、檢測(cè)限
微生物定性檢驗(yàn)的檢測(cè)限是指在替代方法設(shè)定的檢驗(yàn)條件下，樣品種能被檢出的微生物的最低數(shù)量。由于微生物所具有的特殊性質(zhì)，檢測(cè)限是指在稀釋或培養(yǎng)之前初始樣品所含有的微生物數(shù)量，而不是指檢驗(yàn)過(guò)程中某一環(huán)節(jié)的供試液中所含有的微生物數(shù)量。例如，微生物限度檢查中規(guī)定不得檢出沙門菌，對(duì)檢測(cè)限而言，是指每10g樣品中能被檢出的沙門菌的最低數(shù)量。
檢測(cè)限確定的方法是在樣品中接種較低濃度的試驗(yàn)菌（每單位不超過(guò)5CFU)，然后分別采用藥典方法和替代方法對(duì)該試驗(yàn)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，以檢出與否來(lái)比較兩種方法的差異。試驗(yàn)菌的接種量須根據(jù)試驗(yàn)而定，以接種后采用藥典方法50 ％的樣品可檢出該試驗(yàn)菌為宜。檢測(cè)限驗(yàn)證至少應(yīng)重復(fù)進(jìn)行5 次。對(duì)于同一種試驗(yàn)菌可采用卡方檢驗(yàn)（χ2）來(lái)評(píng)價(jià)兩種方法的檢測(cè)限是否存在差異。
3、重現(xiàn)性
微生物定性檢驗(yàn)的重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗(yàn)結(jié)果的精密度。重現(xiàn)性可視為微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測(cè)定該驗(yàn)證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)量的試驗(yàn)菌（接種量應(yīng)在檢測(cè)限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢驗(yàn)，采用卡方檢驗(yàn)（χ2）來(lái)評(píng)價(jià)兩種方法的重現(xiàn)性是否存在差異。驗(yàn)證過(guò)程中，應(yīng)關(guān)注樣品的一致性。
4、耐用性
微生物定性檢驗(yàn)的耐用性是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據(jù)。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測(cè)定該驗(yàn)證參數(shù)。與藥典方法比較，若替代方法檢驗(yàn)條件較為苛刻，則應(yīng)在方法中加以說(shuō)明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應(yīng)單獨(dú)對(duì)替代方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。
四、樣品中微生物定量檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證
微生物定量檢驗(yàn)一般都涉及菌落計(jì)數(shù)。對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)通常需要使用統(tǒng)計(jì)的方法。由于菌落計(jì)數(shù)服從泊松分布，因此采用泊松分布的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理優(yōu)于采用正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)方法。檢驗(yàn)者往往習(xí)慣采用正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)方法，因此也可以通過(guò)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換或平方根加l 的方法將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩種統(tǒng)計(jì)方法都適用于微生物數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。
1、準(zhǔn)確度
微生物定量檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度是指替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與藥典方法檢驗(yàn)結(jié)果一致的程度。準(zhǔn)確度的確認(rèn)應(yīng)在檢測(cè)的范圍內(nèi)，通常用微生物的回收率（% ）來(lái)表示。
檢測(cè)范圍內(nèi)的準(zhǔn)確度都應(yīng)符合要求，準(zhǔn)確度驗(yàn)證的方法是：制備試驗(yàn)菌的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10CFU / ml ）。例如，菌落計(jì)數(shù)平皿法的替代方法，在制備高濃度菌懸液時(shí)，其濃度可以是103CFU / ml , 并系列稀釋至100CFU / ml ．每個(gè)試驗(yàn)菌應(yīng)至少選擇5 個(gè)菌濃度進(jìn)行準(zhǔn)確度確認(rèn)，替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果不得少于藥典方法檢驗(yàn)結(jié)果的70 % ，也可以采用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法表明替代方法的回收率至少與藥典方法一致。當(dāng)替代方法的回收率高于藥典方法時(shí)，有必要結(jié)合專屬性項(xiàng)下的有關(guān)內(nèi)容對(duì)準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2、精密度
微生物定量檢驗(yàn)的梢密度是指在檢驗(yàn)范圍內(nèi)．對(duì)同一個(gè)均勻的樣品多次重復(fù)取樣測(cè)定，其檢驗(yàn)結(jié)果的一致程度，通常采用標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示，也可以采用其他適宜的方式。
精密度驗(yàn)證的方法是：制備試驗(yàn)菌的菌懸液，菌懸液的濃度應(yīng)選擇為能夠準(zhǔn)確讀數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋至較低濃度（如小于10CFU / ml ）。每個(gè)試驗(yàn)菌選擇其中至少5 個(gè)濃度的菌懸液進(jìn)行檢驗(yàn)。每一個(gè)濃度至少應(yīng)進(jìn)行10 次重復(fù)檢驗(yàn)，以便能夠采用統(tǒng)計(jì)分析方法得到標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。一般倩況下，可以接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD ）應(yīng)不大于35 % 。不考慮特殊的檢驗(yàn)結(jié)果，替代方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD ）應(yīng)不大于藥典方法。例如，藥典菌落計(jì)數(shù)平皿法其可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD )與含菌濃度的關(guān)系見表2 。
表2 不同含菌濃度下預(yù)期的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
3、專屬性
微生物定量檢驗(yàn)的專屬性是指通過(guò)檢測(cè)適宜的試驗(yàn)菌，以證明檢驗(yàn)方法與其設(shè)定目的相適應(yīng)的能力。例如，菌落計(jì)數(shù)平皿法其設(shè)定目的在于檢出一定數(shù)量的微生物，則其專屬性驗(yàn)證應(yīng)證明當(dāng)樣品中存在一定數(shù)量的試驗(yàn)菌時(shí)，通過(guò)平皿法檢驗(yàn)，能夠檢出試驗(yàn)菌，而樣品的存在不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。專屬性驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)能夠設(shè)計(jì)出可能使替代方法出現(xiàn)假陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)挑戰(zhàn)替代方法，從而確認(rèn)替代方法的適用性。當(dāng)替代方法不依賴微生物生長(zhǎng)出菌落或出現(xiàn)混濁就可以定量時(shí)（如不需要增菌或在l～50CFU 范圍內(nèi)就可直接測(cè)定菌數(shù)的定量方法），以上驗(yàn)證方式就顯得更為重要。
4、定量限
微生物定量檢驗(yàn)的定量限是指樣品中能被準(zhǔn)確定量測(cè)定的微生物最低數(shù)量。由于無(wú)法得到含有已知微生物數(shù)量的實(shí)驗(yàn)樣品，因此，在定量限驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)選擇在檢驗(yàn)范圍內(nèi)至少5 個(gè)菌濃度．每個(gè)濃度重復(fù)取樣測(cè)定不少于5 次，替代方法的定量限不得大于藥典方法。需要注意的是，由于細(xì)菌計(jì)數(shù)和菌落數(shù)服從泊松分布，可能存在計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差，因此替代方法的定量限僅需證實(shí)在相近的低限度下其靈敏度至少相當(dāng)于藥典方法。
定量限驗(yàn)證的方法是：在檢驗(yàn)范圍的低限制備5 份不同含菌濃度的菌懸液，每份菌懸液分別用藥典方法和替代方法進(jìn)行不少于5 次檢驗(yàn)，采用統(tǒng)計(jì)方法比較替代方法的檢驗(yàn)結(jié)果與藥典方法結(jié)果的差異．從而評(píng)價(jià)替代方法的定量限。
5、線性
微生物定量檢驗(yàn)的線性是指在一定范圍內(nèi)，檢驗(yàn)結(jié)果與樣品中微生物數(shù)量成比例關(guān)系的程度。線性驗(yàn)證時(shí)必須覆蓋能夠準(zhǔn)確測(cè)定的所有濃度范圍。每株試驗(yàn)菌應(yīng)選擇至少5 個(gè)濃度．每個(gè)濃度至少測(cè)定5 次。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以檢驗(yàn)結(jié)果為因變量，以樣品中微生物的預(yù)期數(shù)量為自變量進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r 。當(dāng)相關(guān)系數(shù)不能準(zhǔn)確評(píng)估線性時(shí)．只能確定簡(jiǎn)單大約的關(guān)系值。替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95。
6、范圍
微生物定址檢驗(yàn)的范圍是指能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性，檢驗(yàn)方法適用的高低限濃度或數(shù)量的區(qū)間。
7、重現(xiàn)性
微生物定量檢驗(yàn)的重現(xiàn)性是指相同的樣品在正常的實(shí)驗(yàn)條件（如實(shí)驗(yàn)地．點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)人員、儀器、試劑的批次等）發(fā)生變化時(shí)，所得檢驗(yàn)結(jié)果的精密度。重現(xiàn)性可視為微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)結(jié)果上抵抗操作和環(huán)境變化的能力。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測(cè)定該驗(yàn)證參數(shù)。在樣品中接種一定數(shù)址的試驗(yàn)菌（接種量應(yīng)在定量限以上），采用藥典方法和替代方法，分別由不同人員，在不同時(shí)間，使用不同的試劑（或儀器）進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD ）來(lái)評(píng)價(jià)兩種方法的重現(xiàn)性差異。驗(yàn)證過(guò)程中，應(yīng)關(guān)注樣品的一致性。
8、耐用性
微生物定量檢驗(yàn)的耐用性是指當(dāng)方法參數(shù)有小的刻意變化時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果不受影響的能力，為方法正常使用時(shí)的可靠性提供依據(jù)。方法使用者應(yīng)優(yōu)先測(cè)定該驗(yàn)證參數(shù)。與藥典方法比較，若替代方法檢驗(yàn)條件較為苛刻，則應(yīng)在方法中加以說(shuō)明。替代方法與藥典方法的耐用性比較不是必須的，但應(yīng)單獨(dú)對(duì)替代方法的耐用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便使用者了解方法的關(guān)鍵操作點(diǎn)。
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