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通過基因組改造獲得高產(chǎn)左旋多巴的大腸桿菌
中國微生物菌種查詢網(wǎng) 來源:上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心 / 2016-09-29 13:32:00

   左旋多巴(L-DOPA)又名3-(3,4-二羥基苯基)-L-丙氨酸,是由L-酪氨酸衍生而來的芳香族化合物。L-DOPA用于治療帕金森氏癥,這是由神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺不足引起的疾病。孟山都公司開發(fā)了一個商業(yè)化的、合成L-DOPA的不對稱氫化反應(yīng)過程;目前L-DOPA的合成方法包括化學(xué)合成(不對稱氫化反應(yīng))、酶催化合成以及微生物發(fā)酵合成。化學(xué)合成的極大缺陷在于轉(zhuǎn)化率和對映選擇性都不高,因此被利用酶催化或微生物發(fā)酵的生物技術(shù)方法替代。具有酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶(Tpl)和對羥基苯-3-羥化酶(PHAH)活性的微生物都可被用于合成L-DOPA。但微生物發(fā)酵法需要酪氨酸或鄰苯二酚/丙酮酸作底物,勢必增加了生產(chǎn)成本。Nakagawa等構(gòu)建了一株過表達酪氨酸酶(Streptomycescastaneoglobisporus來源)的大腸桿菌,該工程菌株以葡萄糖為發(fā)酵底物、可合成293mg/L的L-DOPA;Munoz等構(gòu)建了一株帶PHAH活性的大腸桿菌,它以葡萄糖為發(fā)酵底物、能合成1.5g/L的L-DOPA。然而,上述大腸桿菌以葡萄糖為底物的L-DOPA發(fā)酵量遠低于那些以酪氨酸或鄰苯二酚/丙酮酸為底物的發(fā)酵量。因此,后續(xù)工作應(yīng)圍繞提高大腸桿菌以葡萄糖為底物的L-DOPA發(fā)酵量而開展。來自中山大學(xué)劉建忠組對大腸桿菌的基因組進行了基因工程改造,最終獲得一株以葡萄糖為發(fā)酵底物、合成L-DOPA水平最高的工程菌。

  在這項工作中,研究者利用單位點和多位點基因組改造方法、構(gòu)建了一株以葡萄糖為發(fā)酵底物、合成L-DOPA的大腸桿菌。首先利用單位點改造方法構(gòu)建了能合成L-DOPA的大腸桿菌DOPA-1,包括:敲除轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(酪氨酸抑制子tyrR和碳儲存調(diào)節(jié)器AcsrA);將葡萄糖轉(zhuǎn)運由磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)變成依賴ATP的攝入;過表達半乳糖透性酶和葡萄糖激酶編碼基因;敲除葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和預(yù)苯酸脫水酶及其導(dǎo)肽的編碼基因;將融合蛋白嵌合體整合至分支酸鹽的下游途徑。然后,研究者利用多重自動基因工程方法(MAGE)對23個靶標(biāo)位點進行了改造。最終獲得的工程菌株--大腸桿菌DOPA-30N,在5L分批發(fā)酵過程中、在60h可合成8.67g/L的L-DOPA,這是依賴PHAH酶活性、以葡萄糖作發(fā)酵底物獲得的最高水平的L-DOPA。
出自中國微生物菌種查詢網(wǎng)  摘自中國生物技術(shù)信息網(wǎng)

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