一、背景
GV3101(pSoup)菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。
pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup即為GV3101(pSoup)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是一種植物致病菌,能感染絕大多數(shù)雙子葉植物與少數(shù)單子葉植物。農(nóng)桿菌將自身攜帶的Ti質(zhì)粒上的T-DNA(transferred DNA)單鏈拷貝分子—ssT-DNA,即T-strand,整合至植物細(xì)胞基因組中,T-DNA上原癌基因的表達(dá)使植物產(chǎn)生冠癭瘤。在T-strand的運(yùn)輸過程中,農(nóng)桿菌也同時(shí)將自身合成的毒性蛋白分泌至植物細(xì)胞,幫助T-strand從植物細(xì)胞質(zhì)運(yùn)送至細(xì)胞核,并參與其整合過程。為了了解農(nóng)桿菌侵染對(duì)擬南芥基因轉(zhuǎn)錄的影響,揭示擬南芥細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌毒性蛋白與原癌基因表達(dá)反應(yīng)的機(jī)制,以及研究農(nóng)桿菌毒性蛋白的應(yīng)用。
二、應(yīng)用
GV3101(pSoup)感受態(tài)細(xì)胞可用于農(nóng)桿菌引起的擬南芥全基因組轉(zhuǎn)錄變化與VirD2和VirE2蛋白的表達(dá)研究：
比較擬南芥受傷花梗接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)以及冠癭瘤成熟期與幼齡期的光合作用、呼吸作用、脅迫反應(yīng)、激素代謝、核苷酸、RNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂類代謝和信號(hào)傳導(dǎo)等代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化差異,并且表達(dá)農(nóng)桿菌VirD2和VirE2蛋白。
主要結(jié)果如下:1.接種GV3101后基因轉(zhuǎn)錄的時(shí)序變化明顯不同擬南芥花梗受傷后第6天與第3小時(shí)相比,有3885個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,其中3521個(gè)轉(zhuǎn)錄上調(diào),364個(gè)轉(zhuǎn)錄下調(diào)。而受傷且接種農(nóng)桿菌GV3101后的第6天與第3小時(shí)相比,共有4651個(gè)基因發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄,其中4381個(gè)轉(zhuǎn)錄下調(diào),270個(gè)轉(zhuǎn)錄上調(diào);兩種情形下只有1045個(gè)差異轉(zhuǎn)錄基因是相同的。1.1 GV3101的處理中,光合作用、呼吸作用等主要基礎(chǔ)代謝途徑與通路的轉(zhuǎn)錄下降基因數(shù)明顯減少擬南芥花梗受傷后第6天與第3小時(shí)相比,光合作用途徑中有33個(gè)基因發(fā)生了差異轉(zhuǎn)錄,其中2個(gè)上升,31個(gè)下降。
而接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,只有7個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,其中1個(gè)上升,6個(gè)下降。分析表明,光反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄變化最顯著。對(duì)照中有20個(gè)轉(zhuǎn)錄下降的基因參與光反應(yīng),而GV3101處理時(shí)只有6個(gè)。受傷后第6天與第3小時(shí)相比,在糖酵解、氧化磷酸化戊糖、三羧酸循環(huán)、線粒體電子傳遞等呼吸代謝途徑中,分別有17、12、31和45個(gè)基因發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄,而接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,則分別有7、1、17和10個(gè)基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化,其水平全部下降。
對(duì)照中,除了有兩個(gè)氧化磷酸化戊糖代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄上升外,其余的轉(zhuǎn)錄也全部下降。1.2接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,轉(zhuǎn)錄下調(diào)的NB-LRR型抗病蛋白編碼基因明顯增加擬南芥花梗受傷后第6天與第3小時(shí)相比,生物脅迫相關(guān)基因中有50個(gè)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄變化,其中39個(gè)水平下降,11轉(zhuǎn)錄水平上升。而接種農(nóng)桿菌GV3101的條件下,則有119個(gè)生物脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化,其中105個(gè)轉(zhuǎn)錄下降,14個(gè)上升。兩種情形下只有10個(gè)轉(zhuǎn)錄變化基因是相同的。分析表明,轉(zhuǎn)錄變化的PR蛋白編碼基因的差異最顯著。
接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,有67個(gè)PR蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄變化,其中60個(gè)下調(diào),7個(gè)上調(diào)。而在60下降基因中,NB-LRR型抗病蛋白的編碼基因有34個(gè),對(duì)照中則只有5個(gè)。1.3接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,激素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化明顯改變接種農(nóng)桿菌GV3101后第6天與第3小時(shí)相比,激素代謝途徑中有13個(gè)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào),60個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。而對(duì)照中有19個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào),60個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。兩種情形下,只有12個(gè)基因相同。接種農(nóng)桿菌后激素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化明顯不同。
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