厭氧菌的分離鑒定實(shí)驗(yàn)方法！
小楊 / 2020-05-19 08:32:09
一、涂片與染色Smear preparation and stain
標(biāo)本涂片、革蘭染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色性，并估計(jì)標(biāo)本中大致的含菌量，可用“少量”， “+ ”、“ ++ ”、“ +++”、“++++ ”表示。鏡檢不僅能反映各種厭氧菌的特殊形態(tài)，同時(shí)也能為鑒定厭氧菌提供參考和依據(jù)。如脆弱擬桿菌菌體細(xì)長(zhǎng)，兩端尖;韋榮球菌是極小的革蘭陰性球菌。厭氧菌芽胞的位置、形態(tài)、大小對(duì)鑒定很有意義，必要時(shí)作芽胞形成試驗(yàn)。
二、標(biāo)本接種
一般標(biāo)本接種3 個(gè)血瓊脂平板，分別放置于有氧、無(wú)氧和含5 %~ lO % CO2 的環(huán)境中培養(yǎng)。如果只要求檢出厭氧菌，只需接種l 個(gè)厭氧血瓊脂平板，也可增加1 個(gè)相應(yīng)的選擇厭氧血瓊脂平板。為便于在混合培養(yǎng)中及早發(fā)現(xiàn)厭氧菌，一般將標(biāo)本分3 段劃線接種，在第1 和第2 段交界處貼1 張甲硝嘩(5 mg/片)紙片，若出現(xiàn)隱約抑菌圈，則提示有厭氧菌生長(zhǎng)。
不同厭氧菌的生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài)各異，色素也有不同，熒光產(chǎn)生與否也有助于鑒定，根據(jù)上述特征，可初步推測(cè)厭氧菌的種類(lèi)。
1、革蘭陰性桿菌
(1)在BBE 瓊脂平板上有灰黑色、直徑 >lmm 的菌落，菌落周?chē)泻谏臅?，可初步鑒定為脆弱擬桿菌。
(2) 在卡那萬(wàn)古溶血瓊脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德燈照射有磚紅色熒光者，為產(chǎn)黑素普雷沃菌。
(3)菌落沉入瓊脂內(nèi)，使培養(yǎng)基表面留有小坑者，可能是解脲擬桿菌和纖細(xì)擬桿菌。
(4)菌落表面有小斑點(diǎn)，或如面包屑，結(jié)合涂片所見(jiàn)，可初步鑒定為具核梭桿菌。
2、革蘭陰性球茵菌體很小，排列成雙、短鏈或小堆，菌落小，不透明，可能是小韋榮球菌。
3、革蘭陽(yáng)性球菌排列成長(zhǎng)短不等的鏈，可能是消化鏈球菌。
4、蘋(píng)蘭陽(yáng)性無(wú)芽月色桿菌
(1)菌落呈臼齒形、粗糙，結(jié)核腋樣分泌物中有硫黃樣顆粒，可能是放線菌。
(2)菌體呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸桿菌。
5、蘋(píng)蘭陽(yáng)性芽胞桿菌只要見(jiàn)有芽胞，即可鑒定為梭菌屬。菌落有雙環(huán)溶血，卵黃平皿上卵磷脂酶試驗(yàn)和Nagler 試驗(yàn)陽(yáng)性，涂片染色為革蘭陽(yáng)性短粗桿菌，有芽胞，有英膜，可鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。
三、耐氧試驗(yàn)
當(dāng)厭氧平板上有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，為了確定是否為厭氧菌，必須做耐氧試驗(yàn)。從每個(gè)瓊脂平板上挑取4~5 個(gè)性狀不同的菌落，每個(gè)菌落分別轉(zhuǎn)種于2 塊需氧血瓊脂平板和1 塊厭氧血瓊脂平板(每個(gè)瓊脂平板可劃4~6 區(qū)，每區(qū)種一個(gè)可疑菌落) ，然后將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。
凡在厭氧環(huán)境生長(zhǎng)，而在需氧和二氧化碳環(huán)境中不生長(zhǎng)的細(xì)菌為專(zhuān)性厭氧菌(圖3 - 48 中A 區(qū)) ;在需氧和厭氧環(huán)境中均能生長(zhǎng)者為兼性厭氧菌(圖3 - 48 中B 區(qū)) ;在需氧和二氧化碳環(huán)境中生長(zhǎng)，而在厭氧環(huán)境中不生長(zhǎng)者為專(zhuān)性需氧菌(圖3 - 48 中C 區(qū)) ;在需氧、厭氧環(huán)境中均不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不佳，而在二氧化碳環(huán)境中生長(zhǎng)良好的細(xì)菌為需二氧化碳菌(圖3 - 48 中D 區(qū)) 。
四、鑒定試驗(yàn)
可依據(jù)厭氧菌的菌體染色形態(tài)、菌落特性以及對(duì)某些抗生素的敏感性作出初步鑒定。最后鑒定則要進(jìn)行生化反應(yīng)及終末代謝產(chǎn)物等檢查。
生化試驗(yàn)主要包括多種糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)、呵|喋試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、觸酶試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、脂酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及膽汁肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)和硫化氫試驗(yàn)等。目前用于厭氧菌快速鑒定有胞外酶試驗(yàn)， 4 h 即可觀察結(jié)果;自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鑒定厭氧細(xì)菌。
在進(jìn)行厭氧菌分離鑒定的過(guò)程中，需注意下列事項(xiàng)：①厭氧菌標(biāo)本在采集和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中必須與空氣隔絕(厭氧菌暴露于空氣中時(shí)間太長(zhǎng)可死亡) ，務(wù)必在30 min 內(nèi)完成，同時(shí)應(yīng)避免正常菌群的污染。②培養(yǎng)基要新鮮配制，若儲(chǔ)存太久，有氧氣溶解在表面或有過(guò)氧化物在培養(yǎng)基中，不利于厭氧菌生長(zhǎng)。③ 若菌落太小，需用放大鏡觀察菌落。④作耐氧試驗(yàn)，要求從每個(gè)瓊脂平板上挑取4 ~ 5 個(gè)性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置于需氧、二氧化碳和厭氧環(huán)境中培養(yǎng)。⑤ 如作胞外酶鑒定，一定要有足夠的菌液濃度。
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