一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?nbsp;
了解平板劃線(xiàn)分離純種的原理，并熟練掌握該操作法。
二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、培養(yǎng)基平板的制備。
2、用平板劃線(xiàn)分離法分離混菌。
三、實(shí)驗(yàn)原理
平板劃線(xiàn)分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過(guò)分區(qū)劃線(xiàn)稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時(shí)這種單菌落并非都由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點(diǎn)到線(xiàn)”稀釋而達(dá)到分離目的的。
劃線(xiàn)的形式有多種，可將一個(gè)平板分成四個(gè)不同面積的小區(qū)進(jìn)行劃線(xiàn),第一區(qū)(A區(qū))面積最小，作為待分離菌的菌源區(qū)，第二和第三區(qū)(B、C區(qū))是逐級(jí)稀釋的過(guò)渡區(qū)，第四區(qū)(D區(qū))，則是關(guān)鍵區(qū)，使該區(qū)出現(xiàn)大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落,平板上四區(qū)面積的分配應(yīng)是D＞C＞B＞A。
四、實(shí)驗(yàn)器材
大腸桿菌、枯草芽孢桿菌混合菌懸液
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基
無(wú)菌培養(yǎng)皿，水浴鍋，接種環(huán)等。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1、融化培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基放入水浴中加熱至融化。
2、倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右，按無(wú)菌操作法倒 2只平板(每皿約 15m1)，平置，待凝固。
倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持?duì)著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無(wú)名指之間夾住。如果試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速例入培養(yǎng)基約 15m1，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。
3、作分區(qū)標(biāo)記在皿底將整個(gè)平板劃分成 A、B、C、D四個(gè)面積不等的區(qū)域。各區(qū)之間的交角應(yīng)為120℃左右（平板轉(zhuǎn)動(dòng)一定角度約 60℃），以便充分利用整個(gè)平板的面積，而且采用這種分區(qū)法可使 D區(qū)與 A區(qū)劃出的線(xiàn)條相平行，并可避免此兩區(qū)線(xiàn)條相接觸。
4、劃線(xiàn)操作
（1）挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環(huán)，按無(wú)菌操作法挑取少量菌種。
（2）劃 A區(qū)：將平板倒置于煤氣 （酒精）燈旁,左手拿出皿底并盡量使平板垂直于桌面，有培養(yǎng)基一面向著煤氣燈(這時(shí)皿蓋朝上， 仍留在煤氣燈旁)， 右手拿接種環(huán)先在 A區(qū)劃 3—4條連續(xù)的平行線(xiàn)(線(xiàn)條多少應(yīng)依挑菌量的多少面定)。劃完 A區(qū)后應(yīng)立即燒掉環(huán)上的殘菌，以免因菌過(guò)多而影響后面各區(qū)的分離效果。在燒接種環(huán)時(shí)，左手持皿底并將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內(nèi))，以防止雜菌的污染。
（3）劃其他區(qū)：將燒去殘菌后的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基邊緣冷卻一下，并使 B 區(qū)轉(zhuǎn)到上方，接種環(huán)通過(guò) A區(qū)(菌源區(qū))將菌帶到 B 區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線(xiàn)。再?gòu)?B 區(qū)作 C區(qū)的劃線(xiàn)。最后經(jīng) C區(qū)作 D區(qū)的劃線(xiàn)，D區(qū)的線(xiàn)條應(yīng)與 A區(qū)平行，但劃 D區(qū)時(shí)切勿重新接觸 A、B 區(qū)，以免極該兩區(qū)中濃密的菌液帶到 D區(qū)，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環(huán)上的殘菌。
5、恒溫培養(yǎng)：將劃線(xiàn)平板倒置，于 37℃ （或 28℃）培養(yǎng)，24hr 后觀察。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論
1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
檢查每個(gè)平板劃線(xiàn)分離的結(jié)果，并繪制菌苔、菌落分布草圖。
2、討論
針對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟、現(xiàn)象進(jìn)行討論。