細(xì)胞凋亡試劑盒的應(yīng)用！百歐博偉生物
小楊 / 2021-03-30 08:57:38
一、背景
細(xì)胞凋亡試劑盒是用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，來檢測細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。
其檢測原理為：在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。
另外，試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用來區(qū)分存活的早期細(xì)胞和壞死或晚期凋亡細(xì)胞。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI則被排除在活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。
胞凋亡（apoptosis）是研究最多的程序性細(xì)胞死亡，是一個(gè)主動(dòng)、高度有序、一系列酶參與的過程。細(xì)胞凋亡在保證多細(xì)胞生命體健康的過程中扮演著關(guān)鍵角色，對個(gè)體正常發(fā)育具有重要作用，近年來成為生物學(xué)領(lǐng)域中的最熱課題之一。
Annexin V是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結(jié)合。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。用標(biāo)記了熒光素的Annexin V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
二、應(yīng)用
用于奶牛酮病氧化應(yīng)激致肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究：
體外培養(yǎng)奶牛肝細(xì)胞，添加BHBA（0、0.3、1.2、2.4、4.8mM）培養(yǎng)12、24、36h后，應(yīng)用ELISA和qRT-PCR等分子生物學(xué)方法，檢測奶牛肝細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)指標(biāo)GSH-Px、CAT、SOD的活性和mRNA表達(dá)水平、H2O2和MDA含量、總抗氧化能力（total antioxidant capacity,TAC）、抑制羥自由基能力。
結(jié)果表明，高濃度BHBA能夠降低肝細(xì)胞抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的活性和mRNA表達(dá)水平，同時(shí)降低肝細(xì)胞中TAC和抑制羥自由基能力，升高氧化指標(biāo)H2O2和MDA的水平。表明高BHBA可引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激。BHBA通過線粒體依賴的ROS-JNK/ERK通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。
在牛肝細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中添加BHBA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，ROS含量增加，從而促進(jìn)c-Jun N端激酶（C-JunNH（2）-terminal kinase,JNK）活化，抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellular signal-regulatedprotein kinase,ERK）的活化，促進(jìn)抑癌基因p53的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，抑制NF E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor2,Nrf2）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bcl2相關(guān)蛋白X（Bcl-2-associated X protein,Bax）和Bcl-xL/Bcl-2相關(guān)死亡啟動(dòng)子（Bcl-xl/Bcl-2-associated deathpromoter,Bad）的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴結(jié)基因2（B-cell lymphonma gene2,Bcl-2）、Bcl-w和B細(xì)胞淋巴結(jié)extra large（B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xl）的表達(dá)，進(jìn)而引起線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential,MMP）下降，使細(xì)胞色素C（Cytochrome c,cytc）和凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing factor,AIF）釋放，激活半胱氨酸蛋白酶3（caspase3）和多腺苷二磷酸多聚酶（PolyADP-ribose polymerase,PARP）。
表明BHBA可以通過線粒體介導(dǎo)的ROS-JNK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，抑制抗凋亡基因表達(dá)，造成肝細(xì)胞凋亡。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的中國微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！