一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、了解革蘭氏染色原理并掌握其操作。
2、鞏固無菌操作技術(shù)及顯微鏡使用方法。
二、實(shí)驗(yàn)原理
革蘭氏染色法能將細(xì)菌分成兩大類，即革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。在用乙醇進(jìn)行脫色時(shí)，兩種菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，陽(yáng)性菌細(xì)胞壁為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比較厚，結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，而陰性菌細(xì)胞壁比較薄，顏色更容易洗脫出來，所以最終革蘭氏陰性菌為紅色，陽(yáng)性菌為紫色。
三、儀器、試劑與材料
1、菌種：枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌屬25922。
2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、碘液、番紅、95%的乙醇、沙黃、香柏油、二甲苯、蒸餾水。
3、器材：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、擦鏡紙、滴管、吸水紙
四、實(shí)驗(yàn)步驟
1、染色步驟
（1）制片：接種環(huán)蘸取細(xì)菌液置于載玻片，酒精燈外焰加熱玻片進(jìn)行細(xì)菌固定。
（2）初染：添加結(jié)晶紫染色，1min后傾去染色液，蒸餾水沖洗至無色。
（3）媒染：吸干殘留蒸餾水后，加入一滴碘液，作用1min，水洗。
（4）脫色：吸干殘液后，加入95%酒精進(jìn)行脫色，30s后水洗。
（5）復(fù)染：吸干殘液后，用番紅液復(fù)染，1min后，水洗。
（6）鏡檢：吸干殘液后，低倍鏡尋找目標(biāo)物體，再用高倍鏡放大目標(biāo)物，目標(biāo)視野添加香柏油進(jìn)行觀察。
2、平板劃線
（1）左手中指、無名指和小拇指托住無菌平皿。
（2）蓋子用食指和拇指掰開，右手持接種環(huán)進(jìn)行第一區(qū)劃線。
（3）酒精燈灼燒接種環(huán)至通紅，晾涼后進(jìn)行第二區(qū)劃線
（4）重復(fù)（3）進(jìn)行第三、四區(qū)劃線
（5）將平皿置于適宜溫度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。
五、結(jié)果與討論
1、革蘭氏染色結(jié)果
圖1為顯微鏡下的染色結(jié)果，從結(jié)果可以看出，這是革蘭氏陽(yáng)性菌，也就是我們所用的實(shí)驗(yàn)材料之一枯草芽孢桿菌，不過紅色比較零星，這可能是因?yàn)槲覀?br />
在清洗載玻片的時(shí)候不小心清洗過度，將一部分細(xì)菌沖洗掉了，所以效果并不是很好。
而我們所用的另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)材料大腸埃希氏菌屬25922理論上說應(yīng)該是革蘭氏陰性菌，這也就意味著最終顯微鏡下看到的顏色應(yīng)該是紫色，但是試驗(yàn)最后我們只觀察到一片白色，回過頭來思考原因，這可能是因?yàn)槲覀冊(cè)谖奢d玻片的過程中用力過猛用紙巾把細(xì)菌給擦去了，所以最后細(xì)菌都沒了，也就沒有染上相應(yīng)的顏色。
2、平板劃線結(jié)果
下圖為平板劃線結(jié)果，從結(jié)果看，上方的劃線是較為失敗的，菌落都堆在了一起，沒有得到足夠的單細(xì)菌菌落，而下方的劃線結(jié)果則相對(duì)理想一些，因?yàn)榈玫降膯渭?xì)菌菌落相對(duì)更多，但同時(shí)也存在很多黏在一起的菌落，這是比較失敗的一個(gè)部分，反思原因，可能是因?yàn)閯澗€的時(shí)候重復(fù)涂抹了太多次，搞得細(xì)菌都重疊到了一起，下次劃線的時(shí)候一定要加倍注意，努力畫出更符合標(biāo)準(zhǔn)的菌落。
3、討論：
a、革蘭氏染色的關(guān)鍵步驟是什么？為什么？
答：關(guān)鍵步驟是酒精脫色，因?yàn)槿裘撋^度，則陽(yáng)性菌會(huì)被誤認(rèn)成陰性菌（都為紫色）；脫色不足，則陰性菌會(huì)被誤認(rèn)成為陽(yáng)性菌（都為紅色）。
b、造成革蘭氏染色結(jié)果不正確的原因有哪些？
答：（1）細(xì)菌涂片太厚太濃使得細(xì)菌重疊，脫色效果不好會(huì)造成假陽(yáng)性。（2）乙醇脫色過度造成假陰性，脫色不足造成假陽(yáng)性。（3）所用細(xì)菌所處時(shí)期不對(duì)，如菌齡過老、死亡或細(xì)胞壁受損傷的陽(yáng)性菌也會(huì)呈陰性反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)過程要使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的幼齡培養(yǎng)物。
c、劃線完畢后，平皿為什么要倒著放？
答：最主要的原因是防止空氣中的細(xì)菌沉降至瓊脂上造成污染，某些情況下也可以防止水份過多時(shí)污染菌順著側(cè)壁流進(jìn)瓊脂里。此外，培養(yǎng)箱的溫度一般都比較高，而水汽的蒸發(fā)方向是向上的，因此倒置平皿不會(huì)失水過多，可以延緩干燥速度。
六、注意事項(xiàng)
1、細(xì)菌涂片不宜太厚，否則細(xì)菌容易重疊，影響脫色效果。
2、火焰固定不宜過熱，做到玻片不燙手背即可。
3、乙醇脫色是關(guān)鍵操作，脫色過度陽(yáng)性菌會(huì)被誤染成陰性菌，脫色不足，陰性菌會(huì)被誤染成陽(yáng)性菌。
4、劃線的時(shí)候要做到無菌，蓋子盡量往平皿一邊放，不要置于平皿的正上方，避免誤染等，手在進(jìn)行操作時(shí)要先用酒精消毒。
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