一、背景
大鼠脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)ELISA試劑盒用于體外定量檢測(cè)Rat血清，血漿或其他生物體液中天然及部分重組LBP濃度。
二、檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠LBP抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的大鼠LBP會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠LBP抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？勾笫驦BP抗體與結(jié)合在包被抗體上的大鼠LBP結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)OD值，LBP濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中LBP的濃度。
脂多糖（LPS）結(jié)合蛋白（LBP）是存在于正常人中和動(dòng)物血清中的一種糖蛋白，分子量為60kDa，其蛋白質(zhì)部分為456個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈，由肝細(xì)胞合成.LBP與LPS中的脂質(zhì)A具有高度親和性，可作為LPS載體，催化LPS與CD14結(jié)合；LBP還可作為調(diào)理素，促進(jìn)單核細(xì)胞等吞筮調(diào)理后的LPS和革蘭陰性菌.LPS與急性期蛋白脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）結(jié)合，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控及免疫防御屏障機(jī)能下降，引起全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒性休克、急性肺損傷甚至多器官功能障礙綜合征.另有研究表明LBP亦有抗炎作用，LBP發(fā)揮不同的作用是由不同的功能位點(diǎn)決定的.因此說LBP在炎癥反應(yīng)中有雙韌劍的作用。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；3.待測(cè)樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4、隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5、棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7、每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。
四、應(yīng)用
用于脂多糖結(jié)合蛋白對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理研究：
LBP還可促進(jìn)LPS與高密度脂蛋白或巨噬細(xì)胞膜上清除受體（scavenger receptor,SR）的結(jié)合而加速LPS的清除，從而減輕LPS的毒性作用。目前就LBP對(duì)LPS不同調(diào)節(jié)作用的機(jī)制仍不清楚。
圍繞LBP對(duì)LPS的調(diào)節(jié)作用，從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究：
第一，經(jīng)50％飽和硫酸銨溶液鹽析、Bio-Rex70陽離子交換層析和MonoQ陰離子交換層析，從大鼠急性反應(yīng)期血清中分離、純化LBP，為進(jìn)一步研究LBP對(duì)LPS的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
第二，采用RT-PCR和Western-blotting，觀察LPS在誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)及p38MAPK蛋白激酶活化的過程中，LBP對(duì)LPS調(diào)節(jié)作用的時(shí)間和劑量依賴性，從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄水平探討LBP對(duì)LPS的調(diào)節(jié)機(jī)制。
第三，用油酸和LPS復(fù)制一次打擊和二次打擊的大鼠急性肺損傷模型，觀察LBPmRNA的動(dòng)態(tài)變化及山度若堿的保護(hù)作用，探討LBP在體內(nèi)對(duì)LPS的增敏效應(yīng)及山莫蓉堿的保護(hù)機(jī)制。
研究結(jié)果顯示：①從300ml大鼠急性反應(yīng)期血清中分離、純化到762 u g大鼠LBP，純化倍數(shù)達(dá)1570倍。純化的大鼠LBP在SDS－PAGE的60kD處呈單一條帶，并可明顯增強(qiáng)FITC毛PS與外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的結(jié)合。
②當(dāng)LPS為0刀ling幾，LBR為ling／L以下時(shí)，各細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)隨LBP濃度的增加而增高，而10mg／L LBP對(duì)各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的上調(diào)作用反而有所減弱；當(dāng)LPS濃度為ling幾時(shí)，不同濃度的LBP對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)無影響。
③在各時(shí)相點(diǎn)，LBP對(duì)0乃ling／L的LPS均有明顯的調(diào)節(jié)作用，而對(duì)ling／L的LPS無調(diào)節(jié)作用。
④LPS刺激15min后，p38MAPK的磷酸化活性開始增高，30min達(dá)峰值，60min后下降。LPS濃度為0．cling／L時(shí)，LBP對(duì)LPS激活P38MAPK信號(hào)通路有明顯的增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用；LPS濃度為ling／L時(shí)，LBP對(duì)LPS激活p38 MAPK無調(diào)節(jié)作用。
⑤用油酸實(shí)施一次打擊，可使肺組織中LBP的表達(dá)明顯增高。在此基礎(chǔ)上予小劑量LPS進(jìn)行二次打擊后，肺組織中TNF＊和ILJ 0的表達(dá)增高；山度若堿干預(yù)可抑制LBP的上調(diào)，減少TNF·口和IL刁0的表達(dá)，病理改變也明顯減輕。
以上結(jié)果表明：①用50％飽和硫酸鉸沉淀、Bio．Rex70陽離子交換層析和MonoQ預(yù)裝柱的陰離子交換層析，可從大鼠急性反應(yīng)期血清中純化到具有生物學(xué)活性的LBP。②LBP對(duì)LPS的調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性，無時(shí)間依賴性。
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