一、背景
細菌基因組DNA快速抽提試劑盒適用于快速提取各種細菌基因組DNA。采用獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫。本試劑盒也可用于食品致病菌(微生物)基因組提取，如：金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、出血性大腸桿菌O157：H7、單增李斯特、沙門氏菌、阪崎腸肝菌等?？蓮?-5 ml細菌培養(yǎng)液中，快速提取純化10-40μg純凈的基因組DNA，所得基因組DNA可直接用作PCR模板、酶切、雜交等分子生物學實驗。
二、操作步驟
使用前請先在緩沖液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶上的標簽。
1、取細菌培養(yǎng)液1-5 ml，10,000 rpm(~11,500×g)離心1 min，盡量吸凈上清。
2、向菌體沉淀中加入200μl緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。
注意：對于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可略過第2步驟，加入溶菌酶溶液進行破壁處理，具體方法為：加入110μl緩沖液（20 mM Tris,pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2%Triton），和70μl溶菌酶溶液（50 mg/ml，客戶自備，目錄號：RT401），37℃處理30min以上。如果需要去除RNA，可加入4μl RNase A（100 mg/ml）溶液，振蕩15 sec，室溫放置5 min。
3、向管中加入20μl Proteinase K溶液，混勻。
4、加入220μl緩沖液GB，振蕩15 sec，70℃放置10 min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
5、加220μl無水乙醇，充分振蕩混勻15 sec，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
6、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
7、向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
8、向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm(~13,400×g)離心30 sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。
9、重復操作步驟8。
10、將吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5 min，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 min，將溶液收集到離心管中。
三、應用
用于禽多殺性巴氏桿菌基因組重測序、轉錄組分析及其毒力基因鑒定研究：
以禽源多殺性巴氏桿菌強毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株為實驗材料,對三個菌株進行全基因組測序。
結果表明：PmC48-1株、Pm72-4株和Pm731株基因組全長分別為2,304,775 bp、2,259,533 bp、2,260,636 bp,G+C%含量分別為40.38%、40.28%、40.42%,預測的基因數(shù)分別為2131、2028、2068個。
結合已公布的Pm70基因組序列,利用比較基因組學分析獲得四個菌株間的差異基因。比較基因組學分析發(fā)現(xiàn):強毒株PmC48-1株含有一個特有基因簇,通過與參考菌株Pm70基因組比較分析發(fā)現(xiàn)該基因簇全長44,468 bp,兩端含有20 bp與基因PMRS03305（rpL25）的3?端序列同源的定向重復序列,預測基因PMRS03305的3?端是這段基因簇的插入位置;利用PHAST軟件分析發(fā)現(xiàn)該基因簇包含一個完整的噬菌體序列和一個不完整的噬菌體序列,是一個噬菌體相關基因島,編碼67個Coding sequence（CDS）。
提取強毒株PmC48-1株、Pm72-4株和弱毒株Pm731株RNA,進行RNA-seq分析找出強毒株PmC48-1、Pm72-4與弱毒株Pm731共同的差異表達基因,對共同差異表達基因的上調基因和下調基因分別做GO和KEGG Pathway富集分析,選取部分共同差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證。
結果表明強毒株PmC48-1株和Pm72-4株與弱毒株Pm731株共同差異表達基因有190個,其中75個上調,115個下調。GO富集分析顯示這些差異基因在分子功能方面主要涉及催化活性、結合、轉運,在細胞組成方面主要涉及膜和細胞組成,在生物學過程方面主要參與細胞過程、代謝過程和定位。KEGG Pathway富集到的通路有碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝、膜運輸、信號傳導、細胞運動性等通路。選取上調基因4個,下調基因8個,經(jīng)實時熒光定量PCR驗證,其與RNA-seq分析結果基本一致。
為了進一步驗證Pm強弱毒株的差異毒力基因,分別選取基因組學篩到的PmC48-1株噬菌體相關基因島上的6個基因（PP00004、PP00009、PP00019、PP00053、PP00060、PP00068）和轉錄組學篩到的4個上調基因（dppA、fbpA、rsgA-2、PM0472）,共計強弱毒株差異基因10個,進行PmC48-1株單基因突變株的構建。通過同源重組技術篩選雙交換突變株,分析雙交換突變株的遺傳穩(wěn)定性、生長特性和致病性。結果表明,成功構建10個基因的重組替代質粒,篩選到4個基因（PP00004、PP00009、PP00019、dppA）的雙交換突變株,分別命名為PmC48-1Δ4、PmC48-1Δ9、PmC48-1Δ19、PmC48-1ΔdppA。四個突變株連續(xù)傳代20代后其遺傳穩(wěn)定性良好,體外生長曲線與野生型PmC48-1株基本一致。
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