一、基礎(chǔ)知識
1、生物學(xué)特性
形態(tài)特征：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，大小為(1-3.5)um×(0.5-1.3)um，多數(shù)情況單細(xì)胞零散存在，有時排列成短鏈或成堆；不形成芽孢，無莢膜；周生鞭毛。鞭毛的著生與環(huán)境條件有關(guān)：培養(yǎng)溫度在30℃以下時，鞭毛形成，有動力；溫度較高時即喪失，35℃以上則無動力。
培養(yǎng)特性：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌兼性厭氧菌生長，溫度為30-37℃，但在22一29℃該菌的某些特性才能出現(xiàn)；能在0-4℃可以生長繁殖，屬于具有嗜冷性的致病菌；要求較高的水分活度，最低水分活度為0.95,pH接近中性，較低的耐鹽性。對加熱、消毒劑敏感。該菌代時較長，最短也需要40min左右。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在如在SS瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上24h培養(yǎng)后菌落極小，48h可生成圓形、光滑、濕潤、扁平、半透明的菌落，直徑才增大成0.5-3.Omm；在麥康凱瓊脂上菌落淡黃色，如若微帶紅色，則菌落中心的紅色常稍深；在肉湯中生長呈均勻渾濁，一般不形成菌膜。CIN-1平板上，菌落較大，扁平，有明顯的邊緣，中心為深紅色，整個邊緣明顯無色的小菌落（直徑1-2mm)。
生化反應(yīng)特性：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌VP試驗陽性、鳥氨酸脫羧酶陽性，能發(fā)酵山梨醇，甘露醇，不發(fā)酵鼠李糖、棉籽糖等。目前已知小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌生物型為1B, 2,3, 4, 5具有致病性，這些生物型和第6生物型不能快速水解七葉苷和發(fā)酵水楊苷。生物型6相當(dāng)少，可以通過微弱發(fā)酵蔗糖加以區(qū)別，并且毗嗪酞胺酶均為陽性反應(yīng)。目前，從血清型上來說，致病菌株是0：1, 2a, 3; 0: 2a, 3; 0: 3; 0; 8; 0: 9; 0; 4, 32; 0: 5,27; 0: 12, 25; 0: 13a, 13b; 0: 19; 0: 20; 0: 21。引起人類疾病的主要血清群是0:3，0：8，0：9和0：5，27。
2、致病性
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）廣泛分布于自然界，是一種人畜共患的病原微生物，對人以腸道感染為主，并可成為各種疾病的病原。在食品和飲水等受到本菌污染時，往往可引起人的胃腸炎爆發(fā)，其癥狀表現(xiàn)與沙門氏菌食物中毒相似。是歐洲某些國家腹瀉的主要病種，不少地區(qū)耶爾森氏菌引起的胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉，比痢疾還多。除腸道癥狀外，還能引起呼吸道、心血管系統(tǒng)、骨骼、結(jié)締組織和全身疾病，出現(xiàn)敗血癥時病死率達(dá)30%以上。主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱，腹痛、腹瀉、嘔吐、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。耶爾森氏菌病典型癥狀常為胃腸炎癥狀、發(fā)熱，亦可引起闌尾炎。本菌對易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉。1981年我國才發(fā)現(xiàn)此病，引起全國重視，并開展了全國性調(diào)查和研究，分別從人群、動物和外環(huán)境分離出病原菌，證明耶爾森氏菌病在我國的分布是非常廣泛的。
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分布很廣，可存在于生蔬菜、乳和乳制品、肉類、豆制品、沙拉、牡蠣、蛤和蝦等食品及食品原料中。湖泊、河流、土壤和植被往往也存在于該菌；家畜、犬、貓、山羊、灰鼠、水貂和靈長類動物的糞便中也能分離出該菌；港灣周圍，許多鳥類包括水禽和海鷗可能是帶菌者。
二、常用檢驗培養(yǎng)基及檢測原理
常用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的選擇分離培養(yǎng)基為CIN-1平板及改良Y瓊脂。CIN-1平板是一種對耶爾森氏菌選擇性較強(qiáng)的培養(yǎng)基，胰陳和酵母浸膏提供氮源和微量元素；甘露醇為可發(fā)酵糖；去氧膽酸鈉和結(jié)晶紫抑制革蘭氏陽性菌；中性紅是pH指示劑。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在CIN瓊脂上生長良好，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸能使指示劑變紅，所以菌落呈現(xiàn)紅色。不同型的菌株，菌落大小有明顯不同。
改良Y瓊脂中蛋白胨和水解酪蛋白提供氮源和微量元素；乳糖用于糖發(fā)酵試驗；氯化鈉維持正常的滲透壓，去氧膽酸鈉和三號膽鹽抑制革蘭氏陽性菌；丙酮酸鈉刺激目標(biāo)菌的生長；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌不分解乳糖，所以在改良Y瓊脂上不產(chǎn)酸，不能使指示劑孟加拉紅變紅，細(xì)菌不著色，故小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為無色透明菌落。
三、國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法
參照GB/T 4789. 8-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗》。
1、檢驗程序
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢驗程序如圖4-34所示。
2、操作過程
（1）增菌以無菌操作稱取25g（或25mL)樣品放入含有225mL改良磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋中，以8000r/min均質(zhì)l min或拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)I min。液體樣品或粉末狀樣品，應(yīng)振蕩混勻。于26℃±1℃增菌48-72h。除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5mL與堿處理液4.5mL充分混合15s。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌比其他革蘭氏陰性細(xì)菌生長慢，其生長往往易被掩蓋。經(jīng)弱堿液處理，立即接種選擇性平板進(jìn)行分離，提高小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢出率。
（2）分離培養(yǎng)將乳及其制品增菌液或經(jīng)過堿處理的其他食品增菌液分別接種CIN-1瓊脂平板和改良Y瓊脂平板，于（26±1)℃培養(yǎng)48h±2h，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在CIN-1平板上紅色牛眼狀菌落；改良Y瓊脂平板上生長為無色透明、不黏稠的菌落。
改良Y瓊脂的分離率高于麥康凱和SS培養(yǎng)基，因此選用CIN-I和改良Y瓊脂結(jié)合使用，可以達(dá)到較好的分離選擇效果。
（3）改良克氏雙糖試驗分別挑取上述可疑菌落3.5個，接種改良克氏雙糖斜面，于26℃±1℃培養(yǎng)24h，改良克氏雙糖管斜面和底部皆產(chǎn)酸者（變黃）不產(chǎn)氣者被認(rèn)為可疑耶爾森氏菌，做進(jìn)一步的生化鑒定。
（4）尿素酶試驗和動力觀察將改良克氏雙糖可疑培養(yǎng)物接種到尿素培養(yǎng)基上（接種量要大，挑取一接種環(huán)，振搖幾秒），放置于26℃培養(yǎng)2-4h，然后將尿素酶陽性者接種兩管半固體瓊脂，分別放置26℃和37℃恒溫箱，培養(yǎng)24h檢查，如在26℃有動力學(xué)陽性，進(jìn)行鏡檢和進(jìn)一步的生化試驗。
（5）革蘭氏染色鏡檢將上述可疑菌落做涂片染色，進(jìn)行顯微鏡觀察，呈革蘭氏陰性球桿菌，有時呈橢圓或桿狀，大小為(0.8-3.0) um × 0.8um。
（6）生化特性鑒定將上述可疑的菌落做進(jìn)一步的生化鑒定試驗，主要有VP試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗，山梨醇、甘露醇、蔗糖、棉籽糖、鼠李糖等發(fā)酵試驗，所有的生化反應(yīng)皆在26℃培養(yǎng)。VP試驗陽性、鳥氨酸脫羧酶陽性、棉籽糖陰性、山梨醇陽性、甘露醇陽性、鼠李糖陰性、蔗糖有不同生化型的可判斷為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（表4-22)。
注：＋陽性；一陰性；d不同生化型。
綜合以上生化特性結(jié)果，報告25g或25mL樣品中檢出或未檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。
可選擇使用兩種生化鑒定系統(tǒng)（API20E或VITEKGNI+）中任一種，代替常規(guī)的生化鑒定。
①API20E：從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個菌落，按照API20E操作手冊進(jìn)行并判讀結(jié)果。
②VITEK全自動細(xì)菌生化分析儀：從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取單個菌落，按照VITEKGNI＋操作手冊進(jìn)行并判定結(jié)果。
（7）血清學(xué)鑒定除進(jìn)行生化學(xué)鑒定外，亦可做血清型別的鑒定。目前國內(nèi)可生產(chǎn)27種O型血清因子，供各地使用，具體操作方法與沙門氏菌O因子血清分型相同。
四、FDA/BAM小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗
該法檢驗程序如圖4-35所示。
小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在麥康凱平板上為小的（直徑1-2mm)、偏平、無色的或淡粉紅色菌落。在CIN平板上為具有緊紅色中心整個邊緣明顯無色的小菌落（直徑1-2mm)。用接種針將所選菌落穿刺接種于賴氨酸精氨酸鐵瓊脂（LAIA）斜面，室溫培養(yǎng)48h。在LAIA中的培養(yǎng)物會產(chǎn)生堿性斜面，酸性底層，不產(chǎn)生氣體和H2S (KA-）的反應(yīng)，被認(rèn)為是尿素酶陽性的可疑耶爾森氏菌。去除在LAIA中產(chǎn)H2S或產(chǎn)氣或尿素酶陰性的培養(yǎng)物。將LAIA斜面上的培養(yǎng)物劃線接種于厭氧卵黃瓊脂（AEY)，置室溫培養(yǎng)。使用AEY上的生長物進(jìn)行純度檢查、脂肪酶反應(yīng)(2-5d),氧化酶試驗、革蘭氏染色和生化試驗的接種。耶爾森氏菌為氧化酶陰性、革蘭氏陰性的桿菌。
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