一、背景及概述
熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）即熱帶念珠菌，是常見的假絲酵母。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)有270余種念珠菌，其中引起人類致病的念珠菌主要有白色念珠菌(C.albicans)、熱帶念珠菌(C.tropical)、假熱帶念珠菌(C.pseudotropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、克柔念珠菌(C.kruseii)、星形念珠菌(C.stellatoidea)、光滑念珠菌(C.glabrata)、高里念珠菌(C.guilliermondii)，均為條件致病菌，其中以白色念珠菌毒力最強，也最常見。念珠菌在普通培養(yǎng)基上生長較快，為橢圓形芽生細胞，在特殊培養(yǎng)基上形成菌絲。菌種的鑒別需依靠生化試驗。
熱帶念珠菌(Candida tropicalis)為條件致病菌，在自然界廣泛存在，也可寄居在人體皮膚、陰道、口腔、消化道等部位。當人體抵抗力下降或皮膚局部環(huán)境發(fā)生變化時，熱帶念珠菌即可大量繁殖，引起相應(yīng)部位的感染乃至系統(tǒng)性感染。其致病因子包括其生物膜、菌絲等，因而其感染率高。
二、檢測
目前，多使用顯色法從眾多種念珠菌中區(qū)分熱帶念珠菌，但是，顯色法耗時長，其中，某些顯色法中，熱帶念珠菌的檢測易與光滑念珠菌混淆，不能準確地對熱帶念珠菌進行快速的檢測。因此，建立快速、有效的檢測熱帶念珠菌的方法尤為重要。
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(Loop‐mediated isothermal amplification，LAMP) 是日本學者Notomi等提出一種全新的核酸擴增技術(shù)，該技術(shù)具有特異性強、靈 敏度高、檢測成本低和操作步驟簡便等優(yōu)點。近年來，越來越多的研究人員將該方法運用于細菌、病毒等微生物的檢測或?qū)υ摲椒ㄟM行改進。而實時熒光檢測技術(shù)采用完全閉管操作，排除了其他干擾因素，因而具有高靈敏性的優(yōu)點。
目前，已有關(guān)于將兩種技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)——實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增 (Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification，ReaLamp)檢測方法的相關(guān)研究，但在國內(nèi)尚未有將此新技術(shù)應(yīng)用于熱帶念珠菌的檢測方面的發(fā)明。CN201610407728.5運用上述技術(shù)建立了熱帶念珠菌的ReaLamp檢測試劑盒、引物和方法，并從其特異性、靈敏度、重復(fù)性等方面對該方法進行評價。
CN201610407728.5還提供一種檢測熱帶念珠菌的引物。技術(shù)方案如下：一種檢測熱帶念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列組成為SEQID NO.1 和SEQID NO.2的內(nèi)引物，序列組成為SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列組成為SEQID NO.5的環(huán)引物。
CN201610407728.5還提供一種檢測熱帶念珠菌的方法。技術(shù)方案如下：采用實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒，包括以下步驟：
1)提取待檢測樣品的基因組；
2)加待檢測樣品、所述內(nèi)引物、外引物、和環(huán)引物，以及加熒光染料Ⅰ后構(gòu)成反應(yīng)體系，進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增；
3)檢測擴增產(chǎn)物。
本方法具有以下優(yōu)點：本發(fā)明針對熱帶念珠菌5.8S和26S rRNA基因之間的ITS2區(qū)序列設(shè)計篩選得到特異性的LAMP引物，對熱帶念珠菌的靶標基因具有很好的擴增效率。對非熱帶念珠菌進行ReaLamp的擴增，均未出現(xiàn)非特異性的擴增，說明該引物對熱帶念珠菌有較好的擴增能力。而且，本發(fā)明所述的實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的試劑盒靈敏度高，擴增引物對純培養(yǎng)物中的熱帶念珠菌的靈敏度可達到1.28pg/ul。進行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示具有很好的重復(fù)性。本發(fā)明所述的實時熒光環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法檢測熱帶念珠菌的 試劑盒即檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好，操作簡單、快捷、便于批量檢測等特點，為熱帶念珠菌的檢測提供了新的發(fā)展方向。
三、治療方法
CN201680020951.2提供抗CaENO1抗體(CaS1)及人類化抗體，其作為抗由念珠菌(優(yōu)選為念珠菌屬、更佳地白色念珠菌、熱帶念珠菌)、耐氟康唑念珠菌(優(yōu)選為耐氟康唑念珠菌屬)、鏈球菌或葡萄球菌引起的感染的有效診斷劑或治療性治療。在本發(fā)明中，重組CaENO1及CaS1 scFv經(jīng)成功地表達且純化。CaS1 scFv識別白色念珠菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的ENO1蛋白質(zhì)；尤其CaS1 scFv自臨床結(jié)合至耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌，且對小鼠及人類的彼等耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌具有較弱交叉反應(yīng)性。
本發(fā)明亦提供一種抗原決定基序列，其由位于CaENO1中的以下組成的氨基酸序列：283LYEQLISEYP292(SEQ ID NO:1)、278PQLADLYEQL287(SEQ ID NO:2)、240KGKVGIAMDV249 (SEQ ID NO:3)或278PQLADLYEQLISEYP292(SEQ ID NO:4)。本發(fā)明亦發(fā)現(xiàn)多株IgY抗體對由白色念珠菌表達的重組CaENO1蛋白質(zhì)以及原生 CaENO1展示結(jié)合活性，表明在雞中引發(fā)較強體液性反應(yīng)。用短或長連接符建構(gòu)的抗體庫的復(fù)雜性分別為2.4×106及1.36×107。在嚴格篩選之后，顯性CaS1 scFv特定地識別白色念珠菌及熱帶念珠菌的ENO1蛋白質(zhì)。
另外，CaS1 scFv自臨床結(jié)合至耐氟康唑白色念珠菌及熱帶念珠菌。CaS1亦減弱白色念珠菌的生長且抑制其附著至口腔表皮樣癌細胞(OECM-1)。另外， CaS1顯著抑制白色念珠菌的表面ENO1結(jié)合至纖維蛋白溶酶原，如通過纖維蛋白基質(zhì)-凝膠 降解分析所展示。顯著地，活體內(nèi)動物測試展示CaS1抗體延長患有念珠菌血癥的小鼠的存活時間。因此，本發(fā)明識別對CaENO1具有特定結(jié)合活性的新穎CaS1 scFv單株抗體。所有結(jié)果將共同在抗白色念珠菌和熱帶念珠菌的感染的治療性抗體藥物用于臨床應(yīng)用上提供巨大幫助。
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