結(jié)核分歧桿菌（M.tuberculosis），俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉砀髌鞴?，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病為重要的傳染病。據(jù)WHO報(bào)道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達(dá)200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。
一、實(shí)驗(yàn)室診斷
1、結(jié)核菌素試驗(yàn)
結(jié)核菌素試驗(yàn)是應(yīng)用結(jié)核菌素進(jìn)行皮膚試驗(yàn)來測定機(jī)體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗(yàn)。
（1）結(jié)核菌素試劑 以往用舊結(jié)核菌素（old tuberculin，OT）。系將結(jié)核分枝桿菌接種于甘油肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～8周后加熱濃縮過濾制成。稀釋2 000倍，每0.1ml含5單位。都用純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）。PPD有二種：人結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5單位。
（2）試驗(yàn)方法與意義 常規(guī)試驗(yàn)分別取2種PPD 5個(gè)單位注射兩前臂皮內(nèi)，48～72h后紅腫硬結(jié)超過5mm者為陽性，≥15mm為強(qiáng)陽性，對臨床診斷有意義。若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。
陰性反應(yīng)表明未感染過結(jié)核分枝桿菌，但應(yīng)考慮以下情況：①感染初期，因結(jié)核分枝桿菌感染后需4周以上才能出現(xiàn)超敏反應(yīng)；②老年人；③嚴(yán)重結(jié)核患者或正患有其他傳染病，如麻疹導(dǎo)致的細(xì)胞免疫低下；④獲得性細(xì)胞免疫低下，如艾滋病或腫瘤等用過免疫抑制劑者。為排除假陰性，國內(nèi)有的單位加用無菌植物血凝素（PHA）針劑 ，0.1ml含10μg作皮試。若24h紅腫大于PHA皮丘者為細(xì)胞免疫正常，若無反應(yīng)或反應(yīng)不超過PHA皮丘者為免疫低下。
2、結(jié)核菌γ干擾素釋放試驗(yàn)
細(xì)胞免疫介導(dǎo)的結(jié)核菌γ干擾素釋放試驗(yàn)（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA，又稱IFNGRA或GRA）是近年來采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法定量檢出受檢者全血或外周血單個(gè)核細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的IFN-γ檢測釋放反應(yīng)，用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷。IFN-γ為Thl細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，不但能夠反映機(jī)體結(jié)核的Thl細(xì)胞免疫情況，還與體內(nèi)結(jié)核菌的抗原含量密切相關(guān)。被結(jié)核分枝桿菌抗原致敏的T細(xì)胞再遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生高水平的IFN-γ，因此被用于結(jié)核潛伏感染的診斷。
美國FDA已批準(zhǔn)的基于ELISA的QuantiFERON-TB（GIT-G）和歐洲使用的基于ELISPOT的T-Spot.TB，都是以早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白-10（CFP-10）為抗原的。其中，QFT-G又出現(xiàn)了一種用試管的改良方法，稱為QFT-GIT（QFT-inTube）。ESAT-6和CFP-10都是從短期培養(yǎng)的濾液中分離的低分子量蛋白質(zhì)，具有良好的免疫原性，而且它們是選自結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)1（region of difference，RD1）基因編碼的結(jié)核桿菌特異性蛋白。某些TIGRA試驗(yàn)除了上述2種抗原外，還常用TB7.7抗原。TB7.7是結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)13（RDl3）基因編碼的結(jié)核桿菌特異性抗原。這3種抗原在BCG和絕大部分環(huán)境分枝桿菌中都缺失（除外堪薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌），因此避免了與卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌抗原的交叉反應(yīng)。
TIGRA的敏感性和特異性都強(qiáng)于TsT，特別是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼兒等免疫力低下人群的檢測中。全球有約1300萬人共同感染了HIV和結(jié)核桿菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易從潛伏感染發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核。Jiang等對BCG計(jì)劃接種區(qū)域的100個(gè)HIV共感染患者用T-Spot.TB檢測，結(jié)果顯示T-Spot.TB對于有過BCG接種歷史的HIV共感染的LTBI檢測比TsT更敏感快速，而且特異性高。Balcells等發(fā)現(xiàn)，QFT-G比TST在診斷HIV的LTBI時(shí)更少受免疫抑制的影響。Stephan等發(fā)現(xiàn)，QFT-G和T-Spot.TB在檢測HIV患者的LTBI時(shí)比TST更敏感。QFT-G和T-Spot.TB的協(xié)同性很差，對于不同CD4細(xì)胞數(shù)量的患者有不同的結(jié)果。Aichelburg等發(fā)現(xiàn)，QFTGIT可以用于HIV-1感染者的活動(dòng)性肺結(jié)核檢測。
腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種促炎細(xì)胞因子，在多種自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-α的治療會(huì)導(dǎo)致潛伏性肺結(jié)核轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)性肺結(jié)核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易產(chǎn)生假陰性。研究顯示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介導(dǎo)炎癥疾?。↖MID）患者中檢測LTBI的敏感性和特異性都比TST高。終末期腎病（ESRD）患者感染結(jié)核分枝桿菌的幾率比健康人高10～25.3倍。Lee等比較了QFT-G、T-Spot.TB和TsT在ESRD患者中LTBI的診斷，結(jié)果顯示QFT-G和T-Spot.TB的結(jié)果較類似，但TsT和QFT-G、T-Spot.TB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較遠(yuǎn)。T-Spot.TB的檢出率比QFT-G高（分別為46.9%和40.0%）。然而，也有研究顯示QFT-G由于有許多不確定性結(jié)果，因此不能用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎LTBI的檢測。
Bergamini等應(yīng)用QFT-G、QFT-GIT和T-Spot.TB技術(shù)對496個(gè)0-19歲的兒童和青少年LTBI進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種QFT檢測得出的結(jié)果更相似，QFT相對于T-Spot.TB在4歲以下兒童中得到的非確定性結(jié)果更多。Chun等研究顯示，QFT-GIT比TsT在診斷接種過BCG的兒童中LTBI的特異性更強(qiáng)。
上述研究表明，TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的兒童中，對LTBI的檢出率更高。但是，TIGRA存在無法區(qū)分活動(dòng)期和潛伏期結(jié)核、需要抽血獲取淋巴細(xì)胞、要求專業(yè)的操作人員和具備相應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)室、樣品必須在采集后8h內(nèi)完成等缺點(diǎn)，現(xiàn)階段仍未能完全取代TsT。另外，現(xiàn)階段研究的樣本都非常小，也沒有診斷LTBI的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，對于TIGRA還有待進(jìn)一步研究。
二、微生物學(xué)檢查法
結(jié)核病的癥狀和體征往往不典型，雖可借助X線攝片診斷，但確診仍有賴于細(xì)菌學(xué)檢查。
1、標(biāo)本
標(biāo)本的選擇根據(jù)感染部位?？扇√怠⒅夤芄嘞匆?、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應(yīng)部位分泌液或組織細(xì)胞。
2、直接涂片鏡檢
標(biāo)本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸陽性菌即可初步診斷。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。為加強(qiáng)染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色。將石炭酸復(fù)紅染色過夜，用0.5% 鹽酸乙醇脫色30s，則包括大多結(jié)核分枝桿菌L型也可著色。為提高鏡檢敏感性，也可用金胺染色，在熒光顯微鏡下結(jié)核分枝桿菌呈顯金黃色熒光。
3、濃縮集菌
先集菌后檢查，可提高檢出率。培養(yǎng)與動(dòng)物試驗(yàn)也必須經(jīng)集菌過程以除去雜菌。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標(biāo)本需經(jīng)4% NaOH（痰和堿的比例為1:4，尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1）處理15min，時(shí)間過長易使結(jié)核分枝桿菌L型與非結(jié)核分枝桿菌死亡。尿標(biāo)本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于錐形量筒內(nèi)靜置，取沉淀物處理。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物作涂片染色鏡檢。若需進(jìn)一步作培養(yǎng)或動(dòng)物接種，應(yīng)先用酸中和后再離心沉淀。
4、分離培養(yǎng)
將經(jīng)中和集菌材料接種于固體培養(yǎng)基，器皿口加橡皮塞于37℃培養(yǎng)，每周觀察1次。結(jié)核分枝桿菌生長緩慢，一般需2～4周長成肉眼可見的落菌。液體培養(yǎng)可將集菌材料滴加于含血清的培養(yǎng)液，則可于1～2周在管底見有顆粒生長。取沉淀物作涂片，能快速獲得結(jié)果，并可進(jìn)一步作生化、藥敏等測定和區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌。國內(nèi)學(xué)者已證明結(jié)核分枝桿菌L型可存在于血細(xì)胞內(nèi)或粘附于細(xì)胞表面。這種患者往往血沉加快，用低滲鹽水溶血后立即接種高滲結(jié)核分枝桿菌L型培養(yǎng)基能提高培養(yǎng)陽性率。
5、動(dòng)物試驗(yàn)
將集菌后的材料注射于豚鼠腹股溝皮下，3～4周后若局部淋巴結(jié)腫大，結(jié)核菌素試驗(yàn)陽轉(zhuǎn)，即可進(jìn)行解剖。觀察肺、肝、淋巴結(jié)等器官有無結(jié)核病變，并作形態(tài)、培養(yǎng)等檢查。若6～8周仍不見發(fā)病，也應(yīng)進(jìn)行解剖檢查。
6、快速診斷
一般涂片檢查菌數(shù)需5x103～4/ml，培養(yǎng)需1x102/ml，標(biāo)本中菌數(shù)少于此數(shù)時(shí)不易獲得陽性結(jié)果，且培養(yǎng)需時(shí)較長。已將多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定，每ml中只需含幾個(gè)細(xì)菌即可獲得陽性，且1-2d得出結(jié)果。操作中需注意實(shí)驗(yàn)器材的污染問題，以免出現(xiàn)假陽性。又細(xì)菌L型由于缺壁并有代償性細(xì)胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細(xì)胞膜破裂釋出DNA，以致造成PCR假陰性。用組織磨碎器充分研磨使細(xì)胞破裂后，則可出現(xiàn)陽性。有條件的單位使用BACTEC法，以含14C棕櫚酸作碳源底物的7H12培養(yǎng)基，測量在細(xì)菌代謝過程中所產(chǎn)生的14C量推算出標(biāo)本中是否有抗酸桿菌，5～7d就可出報(bào)告。
近年來國內(nèi)外研究證明臨床各種類型的肺結(jié)核患者中40% 左右分離出L型。經(jīng)治療的結(jié)核病人細(xì)菌型消失，L型常持續(xù)存在。有空洞患者痰中已不排細(xì)菌型者，8% 左右仍可檢出L型。故有學(xué)者建議將多次檢出L型亦作為結(jié)核病活動(dòng)判斷標(biāo)準(zhǔn)之一，細(xì)菌型與L型 均轉(zhuǎn)陰才能作為痰陰性。
三、防治原則
1、預(yù)防
近20年國際組織提出控制結(jié)核病主要方法有：①發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者；②新生兒接種卡介苗。約 80% 獲得保護(hù)力。1940年代中國部份城市調(diào)查肺結(jié)核病死率200/10萬以上。解放后衛(wèi)生條件改善，1973～1977顯示病死率已下降至30/10萬。但1979年以來全國三次大規(guī)模抽樣檢查疫情下降很慢。1979～1990每年患病率遞降率2.8%，痰陽性遞降率為3.0%。死亡率19/10萬，仍為其他傳染病之和的2倍。衛(wèi)生部要求2000年新生兒卡介苗接種率達(dá)90%。據(jù)統(tǒng)計(jì)新生兒時(shí)接種過的人以后的發(fā)病率比未接種過的減少約80%。
卡介苗是活疫苗，苗內(nèi)活菌數(shù)直接影響免疫效果，故已有凍干疫苗供應(yīng)。新的核糖體RNA（rRNA）疫苗已引起關(guān)注，但尚處在試驗(yàn)階段。
2、治療
利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素為第一線藥物。利福平與異煙肼合用可以減少耐藥性的產(chǎn)生。對嚴(yán)重感染，可以吡嗪酰胺與利福平及異煙肼合用。1g干酪灶或空洞約含結(jié)核分枝桿菌106～10。每105～6菌可有1種耐藥突變產(chǎn)生，對2種耐藥需菌1011，故以2藥聯(lián)合應(yīng)用為宜。
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