一、背景
人沙眼衣原體(CT)ELISA KIT是利用ELISA法定量測定血清、血漿或其它相關(guān)液體中沙眼衣原體(CT)含量。
二、實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中沙眼衣原體(CT)水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入沙眼衣原體(CT)抗原、生物素化的抗沙眼衣原體(CT)抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的沙眼衣原體(CT)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
三、操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
3、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4、每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）100ul，37℃，60分鐘。
5、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6、依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7、依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8、用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
四、應(yīng)用
用于CT259、CT703基因在沙眼衣原體感染細胞中的表達研究：
分析沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）L2血清型在急性感染和持續(xù)感染兩種狀態(tài)下,其基因CT259、CT703的mRNA及蛋白表達,為進一步研究兩基因的生物學(xué)效應(yīng)奠定實驗基礎(chǔ)。
方法：
1、用IFN-γ處理Ct感染的HeLa細胞,吉姆薩染色光學(xué)顯微鏡觀察、以及電鏡觀察,確定沙眼衣原體持續(xù)感染細胞模型建立。
2、采用RT-PCR方法檢測基因CT259、CT703 mRNA在不同細胞模型中的表達。
3、采用Western-blot的方法檢測基因CT259、CT703編碼蛋白在不同細胞模型中的表達。
結(jié)果：
1、成功建立Ct持續(xù)感染細胞模型。
2、RT-PCR結(jié)果顯示:Ct持續(xù)感染狀態(tài)下,在宿主細胞中6h開始檢測到CT259的表達,12小時開始檢測到CT703的表達,持續(xù)感染狀態(tài)下CT259、CT703的表達量無時間依賴性;Ct急性感染狀態(tài)下,在宿主細胞中6小時開始檢測到CT259的表達,12小時開始檢測到CT703的表達,隨感染時間的延長CT259、CT703 mRNA表達量逐漸增加,具時間依賴性。將持續(xù)感染與急性感染各相同時間點CT259、CT703 mRNA灰度值相比較,發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài)下CT259、CT703 mRNA表達水平明顯低于急性感染狀態(tài),差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
3、Western-blot結(jié)果顯示:Ct持續(xù)感染狀態(tài)下,在宿主細胞內(nèi)24h可檢測到CT259和CT703的表達,表達量無時間依賴性;Ct急性感染狀態(tài)下,24h可檢測到CT259和CT703的表達;隨感染時間的延長,蛋白質(zhì)表達量逐漸增加,具時間依賴性;相同時間點持續(xù)感染狀態(tài)下CT259、CT703編碼蛋白的量明顯低于急性感染狀態(tài)。
結(jié)論：
1、成功建立沙眼衣原體持續(xù)感染細胞模型。
2、Ct持續(xù)感染狀態(tài)下基因CT259、CT703 mRNA水平顯著低于急性感染狀態(tài)。
3、Ct持續(xù)感染狀態(tài)下基因CT259、CT703編碼蛋白水平顯著低于急性感染狀態(tài)。
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