一、背景
擬桿菌屬通用PCR試劑盒是一種生物試劑盒，用于檢測(cè)擬桿菌屬的特異性基因。這種試劑盒可以用來(lái)確認(rèn)擬桿菌屬的存在和種類。
二、擬桿菌屬通用PCR試劑盒使用方法
稀釋擬桿菌屬通用PCR試劑盒陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）
1、注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2、標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4、在7號(hào)管中加入5μL 1×10E8拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5、換槍頭，在6號(hào)管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6、換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7、重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
8、如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9、用自選方法純化樣品的DNA。
10、如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11、在標(biāo)記管中按擬桿菌屬通用PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)加入各成分。
12、蓋上蓋子后上機(jī)，按擬桿菌屬通用PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
13、具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。擬桿菌屬通用PCR試劑盒中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí)，最大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的最大吸收光譜在500 nm，最大發(fā)射光譜在530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
14、如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15、如果把擬桿菌屬通用PCR試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
三、應(yīng)用
擬桿菌屬通用PCR試劑盒可以用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血中腸道菌DNA及快速藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)研究：
建立利用實(shí)時(shí)定量PCR(RQ-PCR)檢測(cè)血標(biāo)本中腸道菌DNA的方法并對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行初步檢測(cè)，并建立RQ-PCR快速檢測(cè)腸道菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對(duì)抗生素敏感性的方法，以期能初步了解外科發(fā)熱患者中腸道菌菌血癥的現(xiàn)狀，并建立快速藥敏方法以便有利于指導(dǎo)治療。
選擇脆弱擬桿菌谷氨酰胺合成酶基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，使用擬桿菌屬通用PCR試劑盒建立20μl的RQ-PCR反應(yīng)體系，采用含靶基因特異性擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因組DNA，建立實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血標(biāo)本中脆弱擬菌DNA的方法學(xué)，并對(duì)32份外科發(fā)熱患者的標(biāo)本進(jìn)行了臨床驗(yàn)證。結(jié)果顯示引物和探針特異性好，檢測(cè)靈敏度為10°拷貝／μl(103CFU／ml)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)在0.985～0.999之間。
不同濃度的脆弱擬桿菌樣本檢測(cè)的平均準(zhǔn)確性為(107.30±2.11)％；批內(nèi)及批間重復(fù)性平均變異系數(shù)(CV)分別為(18.44±1.16)％和(19.00±4.47)％。血標(biāo)本中脆弱擬桿菌DNA平均提取效率為(60.13±5.66)％，提取效率平均變異系數(shù)為(15.62±2.47)％。含有同等量脆弱擬桿菌的臨床血標(biāo)本存放在-20℃或-70℃6個(gè)月內(nèi)，脆弱擬桿菌DNA拷貝數(shù)差異無(wú)顯著性(P=0.467～0.840)，該方法可用于臨床標(biāo)本的脆弱擬桿菌DNA檢測(cè)，并具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。
采用此方法學(xué)對(duì)32例外科發(fā)熱患者的84份血標(biāo)本進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示10個(gè)標(biāo)本檢測(cè)到脆弱擬桿菌，陽(yáng)性率約為11.90％，含量約1.78～9.24×103CFU／ml，所有患者的血培養(yǎng)結(jié)果均為脆弱擬桿菌陰性。
在含有相同濃度大腸桿菌的LB液體培養(yǎng)基和血中，分組加入不同的抗生素，并設(shè)立生長(zhǎng)對(duì)照，分別培養(yǎng)1、2、3、4小時(shí)后提取標(biāo)本的基因組DNA，以本研究組先前建立的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大腸埃希菌DNA的方法，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，觀察不同抗生素組和生長(zhǎng)對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線，來(lái)判定藥敏結(jié)果，并與紙片法進(jìn)行比較。
結(jié)果顯示實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大腸埃希菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對(duì)抗生素的藥物敏感性，結(jié)果與常規(guī)紙片法一致，但更快速。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對(duì)菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對(duì)購(gòu)買項(xiàng)目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項(xiàng)目準(zhǔn)確到位，都有相關(guān)人士進(jìn)行維護(hù),確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因?yàn)榇耍本┌贇W博偉生物技術(shù)有限公司與國(guó)內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長(zhǎng)期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！