一、背景
小鼠腎足突基底膜組織提取物是小鼠腎足突基底膜組織提取產(chǎn)物包含小鼠腎足突基底膜組織不同種類的細(xì)胞可以直接用于基因克隆，表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究。腎足突基底膜是腎小球過濾膜的一部分，組成濾膜的中層。
足細(xì)胞（podocyte），即腎小囊臟層上皮細(xì)胞，它附著于腎小球基底膜（GBM）的外側(cè)，連同血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成了腎小球血液濾過屏障。足細(xì)胞特殊的解剖位置，使得其體內(nèi)研究較為困難；又由于正常成年機(jī)體的腎臟足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞不能增殖。足細(xì)胞呈星型多突狀，胞體較大，由胞體伸出許多突起，又稱足突（FP），呈指狀交叉覆蓋于GBM外表面，并通過黏附分子和蛋白多糖分子與GBM相連。
掃描電鏡觀察，可見胞體伸出幾個(gè)大的初級(jí)足突，進(jìn)而分出許多指狀的次級(jí)突起。相鄰兩個(gè)足細(xì)胞之間的次級(jí)突起相互交錯(cuò)穿插，形成柵欄狀，緊貼于毛細(xì)血管基膜外面。兩相鄰的足細(xì)胞之間的裂隙稱為裂孔，直徑約為25nm(也有的書刊標(biāo)注為40nm)，其表面覆蓋著一層拉鏈狀的結(jié)構(gòu)-裂孔膜，厚度約為4-6nm，是血漿蛋白濾液的最后屏障，也是液體進(jìn)出足細(xì)胞的地方。裂孔表面有硫酸蛋白多糖等組成陰離子外衣，是腎小球電荷屏障的重要組分之一。
足突通過肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白組成的動(dòng)態(tài)的舒張系統(tǒng)調(diào)調(diào)解著GBM的肌原張力，從而使足細(xì)胞連同腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和其基膜一起共抵抗毛細(xì)血管內(nèi)的靜水壓，維持著毛細(xì)血管襻的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。并且足突也可以通過其收縮與擴(kuò)張改變裂孔的大小和濾過膜的面積，即而改變超濾稀疏，調(diào)節(jié)腎小球的過濾功能。
足細(xì)胞在正常情況下可以分泌GBM的主要組成成分IV型膠原和纖維連接蛋白（FN）,在促腎纖維化引資等刺激下還能分泌具有降解GBM作用的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和組織蛋白酶，從而在GBM的代謝平衡中發(fā)揮重要作用。
二、應(yīng)用
小鼠腎足突基底膜組織提取物可用于NOD2通過調(diào)控TRPC6離子通道的表達(dá)及活性參與高同型半胱氨酸血癥引起的腎損傷研究：
同型半胱氨酸是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,其代謝異常所導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥是終末期腎病(end stage renal disease,ESRD),以及心血管疾病并發(fā)癥導(dǎo)致的終末期腎病發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子,但是高同型半胱氨酸所致腎損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制迄今尚未完全明確。NOD2(nucleotide binding oligomerzation domain2)屬于模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)家族中的NLRs(NOD-1ike receptors,NLRs)亞家族成員,在免疫調(diào)控與炎性反應(yīng)中起著重要的作用,前期研究證實(shí)其在腎臟多種細(xì)胞中表達(dá)并且有實(shí)驗(yàn)證明小鼠NOD2缺失對(duì)腎臟缺血再灌注和糖尿病腎病中具有保護(hù)作用。
TRPC6(transient receptor potential cation channe6,TRPC6)是具有鈣離子高選擇性的瞬時(shí)電位陽離子通道,作為足細(xì)胞裂孔膜的重要組成蛋白之一,其過度活化可致足細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高,從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和功能障礙,引起腎小球疾病發(fā)生。但是,高同型半胱氨酸血癥中,NOD2是否參與了腎損傷的發(fā)生發(fā)展,及其是否與TRPC6存在調(diào)控關(guān)系并參與此病理過程,至今尚未見報(bào)道。
為此,本課題分別從體內(nèi)和體外兩方面探討在高同型半胱酸血癥中,細(xì)胞內(nèi)固有免疫受體NOD2在腎小球硬化中的作用以及對(duì)TRPC6的調(diào)控機(jī)制,為防治高同型半胱氨酸癥導(dǎo)致的終末期腎病提供新的治療策略。采用PAS染色觀察腎臟的形態(tài)學(xué)變化和電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；ELISA檢測(cè)相關(guān)致炎因子和趨化因子的水平。分別采用定量RT-PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織熒光化學(xué)法,檢測(cè)NOD2在小鼠腎皮質(zhì)以及腎小球足細(xì)胞中的表達(dá)變化。
NOD2對(duì)TRPC6通道的調(diào)控及小鼠足細(xì)胞損傷中的作用體外培養(yǎng)腎小球上皮細(xì)胞(足細(xì)胞),并經(jīng)同型半胱氨酸刺激后,分別利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測(cè)足細(xì)胞中NOD2、TRPC6和nephrin的表達(dá)變化；MDP誘導(dǎo)足細(xì)胞內(nèi)NOD2活化,以及高同型半胱氨酸刺激轉(zhuǎn)染shRNA-NOD2質(zhì)粒獲得的NOD2基因沉默足細(xì)胞后,重復(fù)檢測(cè)上述指標(biāo)。
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