一、背景
鉛黃腸球菌PCR試劑盒是一種專門用于檢測鉛黃腸球菌的體外診斷試劑。它采用了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地檢測出鉛黃腸球菌。
鉛黃腸球菌PCR試劑盒的主要成分包括PCR反應(yīng)液、DNA模板、引物、酶等。其中，PCR反應(yīng)液是PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)，包含PCR反應(yīng)所需的各種成分，如緩沖液、離子、酶等。DNA模板是含有鉛黃腸球菌特異性基因序列的DNA片段，用于擴(kuò)增出特異性片段。引物是一段與DNA模板特異性結(jié)合的短序列，用于啟動(dòng)PCR反應(yīng)。酶是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，用于催化DNA合成。
使用鉛黃腸球菌PCR試劑盒時(shí)，需要將DNA模板、引物和PCR反應(yīng)液混合后進(jìn)行PCR反應(yīng)。在適宜的溫度和條件下，引物與DNA模板特異性結(jié)合，并通過酶的催化進(jìn)行DNA合成，最終得到大量的特異性DNA片段。通過凝膠電泳等技術(shù)對這些片段進(jìn)行檢測和分析，可以確定是否存在鉛黃腸球菌。
二、鉛黃腸球菌PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn)
因此快速靈敏檢測鉛黃腸球菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù)PCR原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1、即開即用，用戶只需要提供DNA模板。
2、引物經(jīng)過精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增鉛黃腸球菌，與其他植物沒有交叉反應(yīng)。
3、提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4、PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。
5、本試劑盒足夠做40μL體系的PCR 50次，但只能用于科研。
三、應(yīng)用
鉛黃腸球菌PCR試劑盒可以用于林麝肺源鉛黃腸球菌FML1805的分離、全基因組測序分析及其蜂膠佐劑滅活疫苗的試制：
從病死林麝肺臟中分離出一株鉛黃腸球菌,命名為FML1805。對此株FML1805進(jìn)行生理生化鑒定和16S r RNA測序分析后,進(jìn)行了小鼠致病性試驗(yàn)、全基因組測序分析及ANI計(jì)算分析,同時(shí)試制了蜂膠佐劑滅活疫苗。疫苗通過動(dòng)物安全試驗(yàn)后分別注射家兔與林麝,并用間接ELISA方法檢測家兔與林麝三免后84 d的血清抗體效價(jià)。
主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
1、林麝肺源鉛黃腸球菌的分離及致病性試驗(yàn)結(jié)合分離菌株的生化試驗(yàn)及鉛黃腸球菌PCR試劑盒16S r RNA的測定比對,死亡林麝肺臟分離菌株為腸球菌屬,并且與鉛黃腸球菌16S r RNA同源性最高;該分離菌株可以引起小鼠發(fā)病,剖檢可見小鼠肺部病變較為明顯、其余臟器也有不同程度充血腫大,制備病理切片后觀察可發(fā)現(xiàn):小鼠心、肝、脾、肺、腎均有不同程度組織病理變化。分離菌株對小鼠半數(shù)致死量為5.9×108CFU/m L;藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離菌株對萬古霉素耐藥、氨基糖苷類幾乎耐藥、頭孢類敏感。
2、全基因組序列測定及分析結(jié)果全基因組序列測定結(jié)果顯示此分離菌株基因組大小為5321641 bp,包含6521個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)。對其進(jìn)行ANI分析計(jì)算后顯示與Enterococcus casseliflavus EC20全基因組平均序列一致性達(dá)到了99.54%,可判斷此分離菌株為鉛黃腸球菌。將測得的全基因組數(shù)據(jù)成功上傳至NCBI,命名為FML1805,登錄號:WEKZ00000000;對全基因組分析結(jié)果顯示含有18個(gè)與耐藥相關(guān)的基因及16個(gè)與毒力相關(guān)的基因。
3、蜂膠佐劑滅活疫苗的試制本研究用天然蜂膠作為佐劑研制滅活疫苗,通過動(dòng)物安全試驗(yàn)后接種于家兔和林麝體內(nèi)。間接ELISA測定家兔和林麝三免后84 d內(nèi)的血清抗體水平,用測得陽性血清OD600nm值(P)比上陰性血清OD600nm值(N)大于等于2.1時(shí)的最小血清稀釋倍數(shù)來表示血清抗體水平,結(jié)果顯示:家兔在完成免疫程序84 d內(nèi)的血清抗體效價(jià)穩(wěn)定在3100倍左右;林麝在完成免疫程序84 d內(nèi)的血清抗體效價(jià)穩(wěn)定在1500倍左右。
綜上,本試驗(yàn)從林麝肺臟分離鑒定出一株革蘭氏陽性球菌,命名為FML1805。測定并分析FML1805全基因組后確定此菌株為耐萬古霉素的鉛黃腸球菌變異株,并研究了此菌株的致病性和耐藥機(jī)制。最后試制蜂膠佐劑滅活疫苗,為鉛黃腸球菌的臨床治療及其預(yù)防工作取得了鋪墊。
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