腐敗希瓦菌PCR試劑盒的知識與應(yīng)用及操作步驟！
小楊 / 2024-01-18 08:46:13
一、背景
腐敗希瓦菌PCR試劑盒是一種用于檢測腐敗希瓦菌的生物試劑盒。腐敗希瓦菌是一種常見的食品腐敗菌，可引起食品腐敗變質(zhì)，對人體健康產(chǎn)生危害。使用PCR試劑盒可以快速、準(zhǔn)確地檢測出腐敗希瓦菌，對于食品檢測和質(zhì)量控制具有重要意義。
腐敗希瓦菌PCR試劑盒通常由一對特異性引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等成分組成。通過PCR反應(yīng)，可以特異性地擴(kuò)增腐敗希瓦菌的DNA片段，從而對其進(jìn)行快速檢測。使用這種試劑盒的操作過程相對簡單，只需將樣品DNA加入到PCR反應(yīng)液中，經(jīng)過一系列溫度變化和反應(yīng)后，即可得到檢測結(jié)果。
腐敗希瓦菌PCR試劑盒具有高靈敏度、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。然而，需要注意的是，PCR技術(shù)雖然具有高靈敏度和特異性，但也可能受到其他因素的干擾，如DNA提取效率、引物設(shè)計等。因此，在使用PCR試劑盒時，需要嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行，并對結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)的分析和解釋。
1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。
2、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。
3、PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)試劑盒說明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時間根據(jù)試劑盒說明書的要求進(jìn)行設(shè)置。
5、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在腐敗希瓦菌的感染。
三、應(yīng)用
從重金屬污染的環(huán)境中采用Cd2+濃度梯度遞增法、極限培養(yǎng)基培養(yǎng)和紫外誘變等方法篩選重金屬Cd2+高耐受和富集的菌株,采用腐敗希瓦菌PCR試劑盒PCR和16SrDNA序列分析對細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定和分析,然后通過重金屬Cd2+添加處理實(shí)驗(yàn),測定其對重金屬的耐受和富集能力,最后對篩選所得的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)條件(溫度、pH等)的優(yōu)化,以期為Cd2+修復(fù)工程菌的制備和環(huán)境重金屬Cd2+的修復(fù)建立基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)方法主要是應(yīng)用不同的篩選和優(yōu)化方法得到重金屬Cd2+高耐受和富集的菌株,通過腐敗希瓦菌PCR試劑盒PCR擴(kuò)增對菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析,將測定的序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫,與數(shù)據(jù)庫中已有的DNA序列進(jìn)行blastn相似性比對,從而對其進(jìn)行初步鑒定。在此基礎(chǔ)上測定和分析獲得的重金屬Cd2+高耐受和富集細(xì)菌對Cd2+的吸收和耐受能力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)過前述三種方法篩選得到三株菌株,其耐受重金屬Cd2+濃度在固體培養(yǎng)基上達(dá)到150mmol/L,液體培養(yǎng)基里面達(dá)到40mmol/L。經(jīng)腐敗希瓦菌PCR試劑盒16S rDNA序列分析初步確定其中兩株細(xì)菌為同一種細(xì)菌(腐敗希瓦菌Shewanella putrefaciens),另外一株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)。對細(xì)菌作高耐受和富集測定及與對照大腸桿菌pop6510比較分析得出,兩種菌對重金屬的耐受和富集濃度均遠(yuǎn)高于大腸桿菌pop6510,富集倍數(shù)分別達(dá)到15倍和6倍。在不同溫度、pH和Cd2+濃度下對這兩種細(xì)菌優(yōu)化培養(yǎng)條件測定確定,其最適宜生長的溫度為30℃,最適pH為7.2,重金屬半數(shù)致死濃度為40mmol/L。
通過以上工作,初步獲得以下結(jié)論:通過Cd2+濃度梯度遞增方法對細(xì)菌的篩選是行之有效的方法,可縮短篩選的進(jìn)程。紫外誘變得到一株細(xì)菌,在誘變實(shí)驗(yàn)中存活率低,但在耐受和富集測定實(shí)驗(yàn)中長勢良好。通過16S rDNA序列分析鑒定細(xì)菌的種類是一種簡便快捷的方法。通過腐敗希瓦菌PCR試劑盒PCR擴(kuò)增和測定細(xì)菌的16S rDNA的序列,直接與GeneBank中已知序列進(jìn)行比對即可初步鑒定菌種。GeneBank豐富的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫資源為環(huán)境細(xì)菌的分析和鑒定開辟了一條重要和簡便的有效途徑。初步鑒定本實(shí)驗(yàn)所篩選得到的細(xì)菌為腐敗希瓦菌(Shewanella putrefaciens)和假單胞菌(Pseudomonas sp.)。通過細(xì)菌的重金屬耐受和富集測定,獲得的兩種細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基上耐受重金屬Cd2+濃度達(dá)到150mmol/L,液體培養(yǎng)基達(dá)到40mmol/L。與大腸桿菌pop6510相比,其耐受重金屬Cd2+濃度高于大腸桿菌pop6510,其重金屬吸收值顯著高于對照菌株。
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