KMST-6細胞系人胚成纖維細胞的培養(yǎng)及應用研究！
小楊 / 2024-01-24 08:29:16
一、背景
KMST-6細胞系人胚成纖維細胞是一種常見的細胞系，它們具有產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)和分泌細胞因子的能力，因此在組織工程、藥物篩選和腫瘤研究等領域被廣泛使用。
KMST-6細胞系人胚成纖維細胞的保存條件是低溫避光，并且該細胞系的生長方式是貼壁生長，需要通過更換培養(yǎng)基來保持細胞的健康生長。這種細胞系可以通過傳代的方式來擴增細胞數(shù)量，以適應不同的實驗需求。
1)復蘇KMST-6細胞系人胚成纖維細胞：以下細胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2)KMST-6細胞系人胚成纖維細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)KMST-6細胞系人胚成纖維細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數(shù)。
b、根據(jù)細胞數(shù)量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
用不同濃度的硫酸鈹作為受試物染毒KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞,通過對靶細胞形態(tài)學變化、細胞毒性、遺傳毒性、相關癌基因和抑癌基因蛋白表達的檢測,探討硫酸鈹對體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細胞的惡性轉(zhuǎn)化機制。為研究鈹及其化合物致肺癌的機制提供一定的科學理論依據(jù)。為鈹及其化合物所致職業(yè)危害的早期診斷和高危人群的監(jiān)護提供重要的依據(jù)。
方法：采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法觀察硫酸鈹(終濃度分別為0.2μmol/L、2.0μmol/L、20.0μmol/L、100.0μmol/L、200.0μmol/L)對KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞的細胞毒性;用單細胞凝膠電泳(SCGE)和微核試驗測定硫酸鈹對人胚肺成纖維細胞的遺傳損傷情況。用不同濃度的硫酸鈹對人胚肺成纖維細胞重復染毒(染毒24h后,終止染毒48h,再染毒24h)后,正常培養(yǎng),分別傳至第3、6、9代,觀察靶細胞的形態(tài)學變化、癌基因蛋白(C-myc、H-ras蛋白)表達水平的改變和抑癌基因P16的異常甲基化。通過觀察細胞形態(tài)變化、細胞生長速度的比較和轉(zhuǎn)化細胞惡性程度測試(ConA凝集試驗),對轉(zhuǎn)化細胞進行生物學性狀鑒定。
結(jié)果：
(1)MTT比色法結(jié)果顯示:硫酸鈹重復染毒KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞后,終濃度20.0200.0μmol/L硫酸鈹染毒組對人胚肺成纖維細胞生長具有明顯的抑制作用,其OD值與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其它濃度染毒組吸光度值雖與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義,但對細胞增殖均有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴效應(r=-0.685,P<0.01)。
(2)遺傳毒性情況:用硫酸鈹染毒KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞后,均出現(xiàn)DNA鏈斷裂損傷,三個染毒組DNA損傷的測定指標(尾長、尾部DNA百分含量、尾矩和Olive尾矩)與對照組間差異均有顯著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明顯的劑量反應關系(rTL=0.840,r Tail DNA%=0.724,rTM=0.791,rOTM=0.851,P<0.05);出現(xiàn)微核率與對照組間差異均有顯著性(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有明顯的劑量反應關系(r=0.830,P<0.05)。
(3)相關癌基因蛋白檢測結(jié)果:不同濃度硫酸鈹染毒KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞后,C-myc蛋白的表達在細胞分別傳至第3、6、9代時,明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05,P﹤0.01),且具有劑量反應關系(r3=0.755,r 6=0.822,r9=0.792,P<0.01);H-ras蛋白在細胞傳至第3代時,雖然與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05),當傳至第6、9代時,染毒組高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05,P﹤0.01)。且具有劑量反應關系(r3=0.163,r 6=0.586,r9=0.845,P<0.05,P<0.01)。
(4)抑癌基因P16甲基化的測定:對照組KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞中抑癌基因P16表達非甲基化條帶,細胞傳至第3代時各染毒組細胞中也表達非甲基化條帶,細胞傳至第6、9代時,除第6代低濃度染毒組表達部分甲基化條帶,其它均表達甲基化條帶。
(5)細胞體外惡性轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果:實驗濃度范圍內(nèi)的硫酸鈹可不同程度誘發(fā)KMST-6細胞系|人胚成纖維細胞形成轉(zhuǎn)化灶,轉(zhuǎn)化細胞生長失去接觸抑制性、飽和密度增大、ConA凝集能力增強等多種細胞發(fā)生惡性變的生物學表型改變。
北京百歐博偉生物技術有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關人士進行維護,確保您在
微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務！也正因為此，北京百歐博偉生物技術有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關系！
下載附件
上一篇：細胞的基本結(jié)構與主要組成部分有哪些？
下一篇：微生物知識分享：發(fā)酵，傳承千年的微生物力量！