MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞的知識與應(yīng)用及相關(guān)研究！
小楊 / 2024-04-15 09:27:39
一、背景
MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系的保存條件為低溫避光，純度規(guī)格為1×10(6)viable cells/ml，產(chǎn)品類別是有機(jī)化學(xué)品。MCF-12F細(xì)胞系來自女性乳腺上皮細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)為上皮細(xì)胞樣。體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗證明，該細(xì)胞系可以持續(xù)進(jìn)行貼壁生長。在實驗操作中，為預(yù)防細(xì)胞污染，需要進(jìn)行無菌操作，如實驗前對超凈臺用紫外燈照射30-60min，然后用75%酒精擦拭超凈臺臺面，并開啟超凈臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10min左右再開始實驗操作。
MCF-12F細(xì)胞系的主要特點是表達(dá)高水平的雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)，同時缺乏人類表皮生長因子受體2(HER2)的表達(dá)。這些特性使得該細(xì)胞系成為研究乳腺癌內(nèi)分泌治療的重要工具之一。此外，MCF-12F細(xì)胞系還可以用于研究乳腺癌的發(fā)生機(jī)制、藥物篩選、腫瘤生物學(xué)等方面的問題。
1)復(fù)蘇MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
利用基因捕獲技術(shù)得到穩(wěn)定傳代的Cav-1單倍不足(haploinsufficiency)乳腺細(xì)胞株(MCF10A-ST1,MCF10A-ST3),Cav-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯降低,并且也已經(jīng)證實Cav-1的單倍不足足以誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生部分轉(zhuǎn)化。但是,其細(xì)胞機(jī)制尚不完全清楚。乳腺癌細(xì)胞的生長受多種因素調(diào)控,如細(xì)胞周期失調(diào),細(xì)胞增殖過度以及內(nèi)分泌失衡等。近來的研究表明,CyclinD1過表達(dá)是乳腺癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要事件。在乳腺癌發(fā)生過程中,CyclinD1的聚集持續(xù)存在于乳腺癌進(jìn)展的各個方面階段,它作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一,在乳腺癌發(fā)生過程中起著關(guān)鍵性作用。
本實驗以正常人乳腺上皮細(xì)胞株(MCF10A)、MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系、Cav-1單倍不足乳腺上皮細(xì)胞株(MCF10A-ST1,MCF10A-ST3)以及乳腺癌細(xì)胞系(MCF7)和MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系為研究對象,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時相,Westernblot方法檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)以及RT-PCR的方法觀察CyclinD1mRNA水平的變化,探討了Caveolin-1的表達(dá)水平與乳腺細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)系及其可能的分子機(jī)制。闡明Caveolin-1在人正常乳腺細(xì)胞早期轉(zhuǎn)化中的部分作用機(jī)制,為進(jìn)一步揭示乳腺癌發(fā)病機(jī)理提供直接的科學(xué)依據(jù)。
結(jié)果如下：(1)Cav-1在單倍不足細(xì)胞株MCF10A-ST3和MCF10A-ST1的表達(dá)分別為MCF10A的50%和30%,而在乳腺癌細(xì)胞系MCF7和MCF-12F人乳腺上皮細(xì)胞系中幾乎沒有檢測到Cav-1的表達(dá);(2)Cav-1單倍不足細(xì)胞時相發(fā)生改變,MCF10A-ST3細(xì)胞株G1期和S期細(xì)胞數(shù)分別為35.4%和56.4%;(3)Cav-1單倍不足乳腺細(xì)胞株中,隨著Cav-1的下調(diào),CyclinD1的蛋白和mRNA水平均增加,P21的表達(dá)下調(diào),而P16的表達(dá)水平?jīng)]有受到影響;(4)Cav-1單倍不足可以激活c-Jun、ER-α的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖,腫瘤發(fā)生。
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