IEC-6大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞的培養(yǎng)技巧有哪些？
小楊 / 2024-04-26 09:41:35
一、細(xì)胞來(lái)源描述
大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞主要來(lái)源于小腸的上皮組織。小腸是消化道的一部分，由十二指腸、空腸和回腸組成。其中，小腸的上皮組織由多種細(xì)胞類型組成，包括隱窩上皮細(xì)胞、吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等。
隱窩上皮細(xì)胞是小腸上皮中最常見(jiàn)的細(xì)胞類型之一。它們位于小腸黏膜的隱窩區(qū)域，形成了許多腺體樣的結(jié)構(gòu)，被稱為小腸隱窩。隱窩上皮細(xì)胞具有分泌黏液和素有保護(hù)作用的功能。
注：該細(xì)胞表達(dá)腸上皮特有抗原。氫化可的松可抑制該細(xì)胞的生長(zhǎng)。（該細(xì)胞體外倍增次數(shù)有限，請(qǐng)使用靠前批次于實(shí)驗(yàn)）
以下是詳細(xì)的IEC-6細(xì)胞培養(yǎng)技巧，包括操作步驟、培養(yǎng)條件、細(xì)胞復(fù)蘇、傳代和凍存等操作步驟：
培養(yǎng)基可以使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清（FBS）。
在培養(yǎng)基中加入10ug/ml胰島素，胰島素是無(wú)血清哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的普遍添加物質(zhì)，在許多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用：如促進(jìn)糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，提高合成代謝降低分解代謝，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)等等。
DMEM +10%胎牛血清+1%P/S+10ug/ml胰島素
注意:
①低溫保存的細(xì)胞非常脆弱，請(qǐng)將凍存管放入37C的水中解凍，盡快復(fù)蘇細(xì)胞。
②提前室溫預(yù)熱培養(yǎng)基。
1、在無(wú)菌區(qū)準(zhǔn)備好 15ml 離心管和 T-25 培養(yǎng)瓶并分別加入 5ml 完全培養(yǎng)基;
2、將凍存管放入 37C水浴鍋中，握住凍存管不停晃動(dòng)，直到內(nèi)容物完全融化。然后立即將凍存管從水浴中取出，擦干并噴灑 75%乙醇，移至無(wú)菌區(qū);
3、小心地拆卸蓋子，不要碰到里面的螺紋，用移液槍輕輕吸出細(xì)胞懸液，加入到準(zhǔn)備好的15ml 離心管中，1000rpm 離心 5min;
4、棄上清后，輕彈離心管底部分散細(xì)胞沉淀，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的 T25 培養(yǎng)瓶 (建議加液量: 5~7ml) ;
5、輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分布，如有必要(如使用不透氣瓶)，松開閥蓋，以便氣體交換
6、將培養(yǎng)瓶放入 CO 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
三、細(xì)胞培養(yǎng)條件
在37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。
維持細(xì)胞的濕度和合適的CO2濃度（通常為5%）。
四、細(xì)胞傳代
1、細(xì)胞未長(zhǎng)至 85%時(shí)，用 75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到生物操作臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，若培養(yǎng)瓶上無(wú)特殊標(biāo)注，吸去剩余培養(yǎng)液，只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞已長(zhǎng)滿達(dá) 85-95%。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下:
（1）棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗滌 1-2 次;
（2）加入 1.0m 胰酶消化液，37C 消化約 10min(消化時(shí)間根據(jù)不同細(xì)胞及所用胰酶有所差異)，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞回縮變圓、透亮、輕拍瓶壁呈流沙樣脫落，則迅速拿回操作臺(tái)，加入至少雙倍的含 10%血清的完全培養(yǎng)液，終止消化并輕輕吹打細(xì)胞.使其變成單細(xì)胞懸液;
（3）將細(xì)胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min，棄上清，輕彈管底，將細(xì)胞彈散：加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代；如果沒(méi)有特別說(shuō)明，建議收到細(xì)胞后的第一次傳代比例為 1:2。
注：①觀察細(xì)胞密度最好用(4X 物)觀察，以確的斷胞密度，觀察細(xì)胞形態(tài)請(qǐng)用(10X 或20X)高倍鏡觀察。②推薦使用 0.25%胰酶EDTA 消化液。③瓶中運(yùn)輸?shù)呐囵B(yǎng)液不能重復(fù)使用，請(qǐng)換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。④有些細(xì)胞貼壁不牢，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落，可離心重后接種到新瓶?jī)?nèi)。
五、細(xì)胞凍存
當(dāng)細(xì)胞達(dá)到合適的傳代次數(shù)時(shí)，可以進(jìn)行凍存以備將來(lái)使用。
使用合適的凍存培養(yǎng)基，含有10%二甲基亞砜（DMSO）和10%胎牛血清。
緩慢添加凍存培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)凍存液的濃度。
將細(xì)胞懸浮液分裝到凍存管中，并在-80°C或液氮罐中冷凍保存。
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