小鼠膀胱平滑肌細胞的培養(yǎng)操作及其應(yīng)用！
小楊 / 2024-04-30 08:54:50
一、背景
小鼠膀胱平滑肌細胞采用酶解法制備而來，α-SMA、Desmin呈陽性，細胞純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。
膀胱壁由三層組織組成，由內(nèi)外為粘膜層、肌層和外膜。其中，肌層由平滑肌構(gòu)成。體外培養(yǎng)膀胱平滑肌細胞不僅為組織工程膀胱，尿道提供種植細胞的必要手段，也是研究平滑肌瘤的基礎(chǔ)與前提。
膀胱是由平滑肌細胞組成的中空器官。膀胱平滑肌的舒張和收縮使得膀胱分別儲存和排出尿液。膀胱平滑肌細胞表型的調(diào)控和可誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達與多種病理狀況有關(guān)，包括膀胱功能障礙。研究表明，組織缺氧抑制人類膀胱平滑肌細胞的增殖，膀胱平滑肌細胞的分化依賴于膀胱上皮細胞釋放的因子。膀胱平滑肌細胞外基質(zhì)的分泌表型可通過細胞所經(jīng)歷的機械變形頻率而改變。平滑肌是許多疾病中的共同路徑，因此，了解在疾病發(fā)生及持續(xù)過程中平滑肌怎樣變化，這是治療方法取得進展的重要一步。
二、培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
三、應(yīng)用
用于SGK1/NFAT2和IL-1β在膀胱出口梗阻中促進膀胱平滑肌細胞增殖及焦亡的研究：
構(gòu)建了慢性膀胱出口梗阻模型及急性膀胱出口梗阻模型,以研究急性梗阻和慢性梗阻之間膀胱的不同病理變化。結(jié)合應(yīng)力-細胞增殖模型去揭示膀胱出口梗阻過程中疾病進展的機制。
方法：將雌性BALB/c小鼠分成3組:對照組（n=9）,逐漸梗阻組（n=9）和直接梗阻組（n=9）。使用逐漸縮窄尿道外口和直接縮窄尿道外口的方法分別來構(gòu)建慢性和急性梗阻模型。在構(gòu)建急性梗阻后1,2和4周,檢測膀胱的病理生理改變。同時對小鼠膀胱平滑肌細胞（MBSMC）進行不同的循環(huán)靜水壓力的施加,然后檢測細胞增殖,炎癥的表達水平以及細胞周期。
用Si RNA干擾敲除
小鼠膀胱平滑肌細胞中的SGK1表達,然后檢測NFAT2的表達。結(jié)果:與慢性膀胱出口梗阻模型相比,急性膀胱出口梗阻模型在膀胱出口梗阻早期導(dǎo)致膀胱出現(xiàn)更強的增殖、炎癥和纖維化。低水平的應(yīng)力刺激可促進小鼠膀胱平滑肌細胞增殖,過大的應(yīng)力刺激會抑制細胞增殖且增加小鼠膀胱平滑肌細胞死亡的比例。
使用SGKI si RNA干擾實驗敲除SGKI后NFAT2的表達明顯下調(diào)。結(jié)論:急性膀胱出口梗阻導(dǎo)致膀胱功能更快失代償。慢性膀胱出口梗阻比急性膀胱出口梗阻具有更強的適應(yīng)能力是一種更加合適的疾病研究模型。
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