小鼠C反應(yīng)蛋白CRPElisa試劑盒的操作步驟及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-05-07 08:46:21
一、背景
小鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)Elisa試劑盒是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測(cè)小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的CRP的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒。CRP，即C-Reactive Protein，是一種非糖基化蛋白，屬于正五聚蛋白家族，其主要功能是作為先天性免疫反應(yīng)的傳感器和活化劑。
二、在使用小鼠C反應(yīng)蛋白（CRP）Elisa試劑盒時(shí)，需要遵循以下步驟：
實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過高時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜,37℃反應(yīng)60分鐘。
3、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4、每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液）100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
6、依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。
7、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8、用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。
三、應(yīng)用
研究對(duì)象血清hs-CRP值采用小鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)Elisa試劑盒酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,Elisa)進(jìn)行檢測(cè)。采用多元logistic回歸分析估算血清hs-CRP水平與老年人群患骨質(zhì)疏松的相對(duì)危險(xiǎn)度OR(odds ratio)值及95%可信區(qū)間(confidence interval,CI)。
基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)部分主要選取8月齡的以C57BL/6J為背景的Nur77基因敲除鼠作為血清hs-CRP偏高的實(shí)驗(yàn)組,同窩的野生型小鼠作為血清hs-CRP正常的對(duì)照組進(jìn)行研究。小鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)Elisa試劑盒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)用于檢測(cè)小鼠血清中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和白介素6(Interleukin-6,IL-6)的變化情況。micro-CT用于檢測(cè)Nur77基因敲除鼠和對(duì)照組鼠股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化,H&E染色和TRAP染色分別用于觀察股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化和破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的變化。股骨中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化主要通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè),炎癥相關(guān)和破骨細(xì)胞生成相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的變化情況主要通過real-time PCR進(jìn)行檢測(cè)。
小鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)Elisa試劑盒結(jié)果:本研究共納入4010名60歲及以上老年人,其中男性1660名(41.4%),女性2350名(58.6%),平均年齡68.9歲,骨質(zhì)疏松患者共1203位,非骨質(zhì)疏松癥患者共2807名,骨質(zhì)疏松癥的患病率為30.0%,其中男性研究對(duì)象骨質(zhì)疏松癥的患病率為27.7%,女性明顯高于男性為31.6%(P=0.008)。60-69歲年齡組共納入研究對(duì)象2568名,骨質(zhì)疏松癥患病率為26.6%,70-79歲年齡組共納入研究對(duì)象1078名,骨質(zhì)疏松癥患病率為33.6%,80歲及以上年齡組共納入研究對(duì)象364名,骨質(zhì)疏松癥患病率43.7%。研究對(duì)象血清hs-CRP的中位數(shù)水平為0.95mg/L,血清hs-CRP水平低于中位數(shù)水平者骨質(zhì)疏松癥的患病率為25.1%,大于等于中位數(shù)水平者骨質(zhì)疏松癥的患病率為34.9%,兩組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
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