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研究銅綠假單胞菌外毒素A（PE)的某些抗原性及其與輔助細(xì)胞的關(guān)系。 

 

 

用MTT法觀察PE在有無(wú)輔助細(xì)胞參與條件下對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用,并用鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞株CTLL進(jìn)行證實(shí)。

 

 

PE在0.01～100ng/ml濃度范圍能刺激鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，PE的絲裂原作用無(wú)需粘附細(xì)胞的輔助，但粘附細(xì)胞及其粘附細(xì)胞的PE刺激上清能協(xié)同PE對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用。PE在絲裂原作用范圍內(nèi)能刺激CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)，并與IL-2有協(xié)同作用。PE在體內(nèi)能使小鼠脾淋巴細(xì)胞自發(fā)淋轉(zhuǎn)率增高，對(duì)ConA刺激的增殖反應(yīng)增強(qiáng)，但對(duì)淋巴細(xì)胞自發(fā)分泌IL-2和ConA誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生水平無(wú)影響。結(jié)論　PE在無(wú)輔助細(xì)胞參與條件下也能刺激淋巴細(xì)胞增殖。

 

銅綠假單胞菌外毒素A（PE)為條件致病菌銅綠假單胞菌分泌的一種相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為66×103的單鏈多肽，可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)：Ⅰ區(qū)系氨基末端區(qū)，與靶細(xì)胞上2-巨球蛋白受體結(jié)合；Ⅱ區(qū)為跨膜區(qū)，與毒素“越膜就位”有關(guān)；Ⅲ區(qū)是羧基末端區(qū)，具有ADPR轉(zhuǎn)移酶活性，為毒素分子的活性部分，通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在亞致死劑量，PE具有其它微生物抗原的性質(zhì)，如：PE能誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化，其刺激作用需要輔助細(xì)胞的處理及提呈等。我們?cè)谘芯縋E對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞的抗原作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)PE在無(wú)輔助細(xì)胞參與的情況下也能刺激淋巴細(xì)胞增殖，現(xiàn)報(bào)告如下：

 

 

動(dòng)物和細(xì)胞株：純系BALB/c雄性小鼠，8～12周齡，購(gòu)自本院動(dòng)物中心，IL-2依賴(lài)株CTLL，引自本院六所；小鼠成纖維細(xì)胞L929，引自本所二室。

 

培養(yǎng)基和試劑：PE(Cal Biochemical Corporation Lot 072291)；ConA(Sigma)；MTT(Fluka)；RPMI 1640(GIBCO)；抗PE多克隆抗體(本室制備)。

 

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：斷頸處死小鼠，無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液(8×106/ml)，取細(xì)胞懸液、PE、ConA等樣品各100μl，加入96孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育不同時(shí)間，用MTT法檢測(cè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

 

脾細(xì)胞懸液中粘附細(xì)胞的去除：調(diào)整BALB/c 小鼠脾細(xì)胞濃度為4×106/ml，置大空斑瓶(底面積5×8cm2)中培養(yǎng)2h，使粘附細(xì)胞貼壁，收集未貼壁細(xì)胞，即為脾非粘附細(xì)胞，通過(guò)姬姆薩染色觀察，粘附細(xì)胞的去除率在95%以上。

 

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（MΦ）的制備：將3ml培養(yǎng)液注入小鼠腹腔，輕揉腹部，吸出腹腔液體，用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次配成2×106/ml，加到24孔平底培養(yǎng)板，1ml/孔，置37℃，CO2孵箱培養(yǎng)2h，棄去未粘附細(xì)胞，粘附細(xì)胞即為小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

 

CTLL細(xì)胞增殖試驗(yàn)：CTLL細(xì)胞株用含20%小牛血清、IL-2 200U/ml的RPMI 1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CTLL細(xì)胞用不含IL-2的完全培養(yǎng)基洗滌2次，取細(xì)胞懸液(106/ml)及PE等樣品各100μl，加入96孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24～48h，用MTT法測(cè)定。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)IL-2和完全培養(yǎng)基對(duì)照。

 

PE免疫小鼠：按本室常規(guī)進(jìn)行。亞致死劑量PE腹腔注射3次，間隔7～10d。

 

 

1、PE的抗原性：用臺(tái)盼藍(lán)染料排除法計(jì)算不同濃度PE與脾細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：PE濃度大于或等于100ng/ml，表現(xiàn)出毒性作用，所以我們將PE的刺激劑量定在100ng/ml以?xún)?nèi)。

 

PE的絲裂原作用：PE在0～100ng/ml范圍設(shè)6個(gè)濃度組，與鼠脾細(xì)胞共同培育1、2、4、7d，測(cè)定淋轉(zhuǎn)值，結(jié)果表明：PE的淋轉(zhuǎn)刺激濃度在0.01～10ng/ml之間，最適濃度為0.01～1.0ng/ml。PE組培育24h，未觀察到淋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度A值逐漸升高，第4天A值最高。ConA刺激組24h即有淋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，最高刺激指數(shù)在第2天就能觀察到。PE的淋轉(zhuǎn)刺激指數(shù)為ConA的1/2，刺激時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，可見(jiàn)，PE為弱絲裂原。

 

PE協(xié)同ConA對(duì)鼠脾細(xì)胞致有絲分裂作用：將ConA固定在2.5μg/ml，分別加入不同濃度的PE，與鼠脾細(xì)胞37℃孵育3～4d，作淋轉(zhuǎn)測(cè)定。結(jié)果顯示：PE在絲裂原作用最適濃度范圍對(duì)ConA的淋轉(zhuǎn)刺激有協(xié)同作用。

 

PE的絲裂原作用與粘附細(xì)胞的關(guān)系：文獻(xiàn)報(bào)道，PE誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞淋轉(zhuǎn)需要輔助細(xì)胞。我們?cè)囼?yàn)了PE刺激脾細(xì)胞淋轉(zhuǎn)與粘附細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PE誘導(dǎo)去除粘附細(xì)胞后的脾細(xì)胞淋轉(zhuǎn)雖不如去除粘附細(xì)胞以前高，但仍能刺激淋轉(zhuǎn)，加入腹腔巨噬細(xì)胞（MΦ）后，刺激值又恢復(fù)到以前的水平。

 

為了弄清是粘附細(xì)胞還是其產(chǎn)生的細(xì)胞因子協(xié)同PE誘導(dǎo)淋轉(zhuǎn)，我們將PE與小鼠腹腔MΦ共培育24h，取培育上清，加入脾非粘附細(xì)胞培育4d，結(jié)果表明：PE與MΦ的培育上清能誘導(dǎo)脾非粘附細(xì)胞轉(zhuǎn)化。刺激值大于PE單獨(dú)刺激的值。雖然PE與粘附細(xì)胞共育上清中殘留一定量的PE，但淋轉(zhuǎn)刺激值較單獨(dú)PE刺激的值要高，則上清中存在某種細(xì)胞因子參與PE的刺激作用。

 

2、PE免疫小鼠脾細(xì)胞免疫功能的測(cè)定：為了了解PE在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞免疫的影響，我們用PE免疫小鼠3次后，無(wú)菌取脾制成細(xì)胞懸液，觀察在有或無(wú)ConA刺激下，脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2產(chǎn)生水平。表1顯示：PE免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞自發(fā)淋轉(zhuǎn)A值高于正常小鼠對(duì)照組，而IL-2分泌水平兩組差異無(wú)顯著性。PE免疫小鼠脾細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)較正常小鼠對(duì)照組明顯增強(qiáng)，而對(duì)ConA誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生水平與對(duì)照組差異無(wú)顯著性。結(jié)果表明：PE的絲裂原作用可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖，對(duì)脾細(xì)胞分泌IL-2能力無(wú)影響。

 

3、PE對(duì)CTLL細(xì)胞的作用：為了驗(yàn)證PE的抗原作用在無(wú)輔助細(xì)胞參與的情況下也能進(jìn)行，我們用鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞株CTLL進(jìn)行了證實(shí)。

 

PE刺激CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)：以不同濃度PE與洗滌后的CTLL細(xì)胞共孵育24～48h，用MTT法觀察CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)：PE能刺激IL-2依賴(lài)株CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)，最佳刺激劑量范圍與淋轉(zhuǎn)相同，即0.01～1ng/ml，可見(jiàn)PE在無(wú)輔助細(xì)胞的參入下也能刺激淋巴細(xì)胞增殖。

 

PE協(xié)同IL-2刺激CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)：將IL-2濃度固定在50U/ml，加入不同濃度PE，與CTLL細(xì)胞共孵育24～48h，發(fā)現(xiàn)PE在較大范圍(0.001～10ng/ml)內(nèi)對(duì)IL-2的刺激有協(xié)同作用，最佳刺激劑量為0.01～1.0ng/ml。

 

我們采用2種方法使PE失活：①PE與抗PE血清37℃作用60min。②PE經(jīng)70℃加熱處理30min。2種方法處理后，PE對(duì)細(xì)胞L929的毒性消失(傳代細(xì)胞L929是文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)PE最敏感的細(xì)胞，能作為指示細(xì)胞判斷PE的毒力)，處理后的PE對(duì)CTLL細(xì)胞的刺激作用消失，說(shuō)明CTLL細(xì)胞的增殖由PE引起。

 

 

銅綠假單胞菌外毒素A具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞增殖分化，PE對(duì)鼠胸腺細(xì)胞的抗原作用需要輔助細(xì)胞的處理和提呈，為了了解PE對(duì)細(xì)胞免疫的影響，我們觀察了PE在體內(nèi)外對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞的作用。鑒于PE對(duì)許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞有毒性，所以在實(shí)驗(yàn)前，首先用臺(tái)盼藍(lán)試驗(yàn)確定了PE對(duì)鼠脾細(xì)胞的毒性劑量范圍。結(jié)果顯示：當(dāng)PE劑量大于或等于100ng/ml時(shí)，對(duì)脾細(xì)胞顯示明顯毒性作用。以亞致死劑量PE與脾細(xì)胞共孵育時(shí)發(fā)現(xiàn)：PE對(duì)脾細(xì)胞有絲裂原作用，最佳刺激劑量為0.01～1ng/ml，刺激高峰時(shí)間為4d。與ConA相比，其所需劑量比ConA低1000倍，但刺激時(shí)間較長(zhǎng)，淋轉(zhuǎn)刺激值比ConA低1倍以上。所以PE是弱絲裂原。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中得出的PE最適劑量范圍較國(guó)外報(bào)道的劑量低100倍，可能是產(chǎn)品來(lái)源不同、純度不同或其它原因。進(jìn)一步觀察PE的絲裂原作用與粘附細(xì)胞的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：在沒(méi)有粘附細(xì)胞參入下，PE也能刺激淋巴細(xì)胞增殖，不象國(guó)外報(bào)道的那樣需要粘附細(xì)胞的輔助。但國(guó)外報(bào)道的是PE刺激胸腺細(xì)胞淋轉(zhuǎn)需要粘附細(xì)胞輔助，可能胸腺細(xì)胞與脾細(xì)胞的表面受體和分子有所不同或其轉(zhuǎn)化機(jī)制不同所致。此外，我們發(fā)現(xiàn)：分別加入鼠腹腔巨噬細(xì)胞、PE刺激腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清能提高PE對(duì)脾非粘附細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，這與國(guó)外報(bào)道PE刺激的粘附細(xì)胞上清能取代粘附細(xì)胞導(dǎo)致胸腺細(xì)胞淋轉(zhuǎn)的結(jié)果有相似之處。這些結(jié)果說(shuō)明：上清中存在的某種細(xì)胞因子可刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而不是由輔助細(xì)胞處理PE再呈遞給淋巴細(xì)胞而使后者轉(zhuǎn)化。推測(cè)PE對(duì)脾細(xì)胞絲裂原作用的可能機(jī)制是：PE對(duì)脾細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞和粘附細(xì)胞均有作用，脾淋巴細(xì)胞直接受毒素結(jié)構(gòu)上某表位的刺激而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化，粘附細(xì)胞則吞噬、處理PE，釋放出PE片段或(和)某種細(xì)胞因子，再進(jìn)一步促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在PE對(duì)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，粘附細(xì)胞（吞噬細(xì)胞）起到協(xié)同、輔助的作用。

 

為了探討PE淋轉(zhuǎn)的直接誘發(fā)機(jī)理，我們將PE與鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞株CTLL（IL-2依賴(lài)株）共孵育24～48h，發(fā)現(xiàn)PE在0.01～1ng/ml劑量范圍能刺激CTLL細(xì)胞生長(zhǎng)，并與IL-2有協(xié)同作用。CTLL細(xì)胞為傳代細(xì)胞，不含有粘附細(xì)胞，PE能使CTLL細(xì)胞增殖，必然也能直接作用于脾細(xì)胞而無(wú)需依賴(lài)粘附細(xì)胞的輔助。PE加熱70℃處理和抗PE血清中和后失去對(duì)CTLL細(xì)胞的刺激作用，PE究竟與細(xì)胞上哪部分結(jié)合，通過(guò)何種途徑刺激淋巴細(xì)胞增殖將是我們今后要研究的課題。國(guó)內(nèi)外目前還未見(jiàn)此方面的研究報(bào)道。

 

我們觀察到：PE在體內(nèi)能增強(qiáng)脾細(xì)胞的自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)脾細(xì)胞的IL-2分泌無(wú)影響，與國(guó)外報(bào)道PE在體外不能誘導(dǎo)脾細(xì)胞IL-2分泌的結(jié)果相似。實(shí)驗(yàn)中觀察到：PE免疫的鼠脾細(xì)胞對(duì)ConA的反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PE在體外與ConA也有協(xié)同作用，而國(guó)外報(bào)道PE在體外抑制PHA誘導(dǎo)的人外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用，兩者實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，有可能是人與鼠的免疫應(yīng)答不同，或ConA與PHA絲裂原作用機(jī)理、方式不同之故。

 

目前，對(duì)銅綠假單胞菌感染的防治是世界上迫切期望解決的問(wèn)題，弄清PE的作用機(jī)制，包括PE對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，將有助于人類(lèi)最終攻克這一疾病。

 

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