IM-9 人外周血B淋巴細胞的轉化方法與實驗步驟！
小楊 / 2024-07-12 09:14:32
EB 病毒的特性之一是能使人外周血B 淋巴細胞轉化，使其成為連續(xù)分裂，永久生存的類淋巴母細胞樣細胞，即永生化細胞。每一永生細胞株都保存了原來提供血樣個體的完整基因組，為研究世界上不同人種、不同民族的遺傳結構，不同個體、不同人群對疾病的易感性，特別是對家族性遺傳疾病和地方性疾病的易感性，提供了寶貴的遺傳資源。
一、細胞簡介
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細胞信息：IM-9
細胞別稱：IM 9; IM9; GM04680
種屬：人
組織來源：外周血，B淋巴細胞
生長特性：懸浮細胞
細胞形態(tài)：淋巴母細胞樣
生物安全等級：2 [Cells contain Herpesvirus]
生長培養(yǎng)基：RPMI-1640 ＋10% FBS ＋1% P/S
推薦傳代比例：1:2-1:4
推薦換液頻率：2~3次/周
倍增時間：~45 hours
凍存條件
凍存液：55% 基礎培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO
溫度：液氮
培養(yǎng)條件
氣相：空氣，95%；CO2，5%
溫度：37℃
用途：研究
注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產品信息以出庫為準）
二、材料與設備
1、無菌材料
細胞培養(yǎng)瓶T25 、T75, 凍存管，一次性小濾器，一次性離心管15ml 、50ml, RPMI1640, 青／鏈霉素，肝素，胎牛血清，HEPES, 淋巴細胞分離液，環(huán)抱素A, EB 病毒，PHA, 二甲亞砜，凍存液，防護手套。
2、設備
二級無菌操作柜、CO2 培養(yǎng)箱、4℃ 冰箱、－20℃ 冰箱、－70 °C 冰箱、離心機。
三、實驗步驟
1、靜脈取血3~4ml，加等量RPMI1640 （每毫升培養(yǎng)液含青霉素100U/鏈霉素100μg) 稀釋血液，混勻。
2、15ml 離心管加4ml 淋巴細胞分離液，將稀釋好的血液緩緩地加到淋巴細胞分離液液面上。
3、離心，每分鐘2500 轉離心30min，或每分鐘3000 轉離心25min。
4、淋巴細胞分離液液面上有一層白膜（即淋巴細胞），將白膜層輕輕吸出。移入15ml 離心管內。
5、用RPMI 1640 （每毫升培養(yǎng)液含青霉素100U/鏈霉素100μg) 清洗3 次。
6、第三次清洗完成后，棄去上清液把細胞輕輕懸起，加2ml 的RPMI1640完全培養(yǎng)液、1.2ml EB 病毒、0.4ml 環(huán)玸素A 、0.2mlPHA 把細胞輕輕混勻，然后分2 個細胞培養(yǎng)瓶，A、B 兩條線進行培養(yǎng)， 37°C培養(yǎng)箱，無需CO2
7、24h 后鏡下觀察，如細胞明顯增大并聚團，懸浮生長，則說明細胞轉化成功。
8、每隔1~2d 少量補液，當瓶內培養(yǎng)液量達到2/3 時，就需要半量換液，從培養(yǎng)瓶中取出體積的1/2 量或更多一點的培養(yǎng)液棄掉，加入等量的完全培養(yǎng)液。
9、細胞凍存，當細胞量達到1 x107個時就可以凍存，每凍存管細胞量1 x 106~ 1.2×106。凍存前1d 需換新鮮培養(yǎng)液。
10、細胞放入凍存管后，用棉花把凍存管包裹約2 寸厚放入－70℃冰箱， 24h后放入液氮罐中。
四、EB 病毒的制備
1、復蘇B-958 細胞， 37℃ 水浴中解凍， 用10ml PBS 洗1 次，棄去上清液。
2、將細胞溶解于 8ml 的RPMl1640 憲全培養(yǎng)液中，接種于T25 細胞培養(yǎng)瓶中。
3、每隔1 ~2d 補充一定數(shù)量的培養(yǎng)液， 直至達到所需的毫升數(shù)時，饑餓4~7d, 收集上清液。
4、于－70℃及37℃ 反復凍融3 次。
5、以每分鐘1500 轉的速率離心15min 。
6、過濾( 0.22μm ）。
7、分裝1.5~ 10ml,，-70 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>
五、試劑的配制
1、抗生素的配制 青霉素和鏈霉素， 一般配制的濃度為10000U/ml 和10 000μg/ml ，用無菌的D-hanks 溶液或生理鹽水溶解，分裝小瓶， 5ml／瓶，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r每1 00ml 培養(yǎng)液加1ml 雙抗（每毫升培養(yǎng)液含音霉素100U/鏈霉素100μg )
2、抗凝藥 一般采用每毫升全血加25U 肝素抗凝。市售肝素每2ml 含12500U,取肝素0.4ml (2 500U) 加無菌生理鹽水至10ml （濃度為250U/ml ), 分裝，放4℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ亢辽?. 1ml 濃度為250U/ml 的肝素。
3、1mo/L HEPES 稱HEPES 粉末23.85g, 溶解在80ml 三蒸水中， 用1mol/L的NaOH 調pH 至7.0, 定容至100ml ，過濾除菌，分裝小瓶， 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>
4、環(huán)孢素A 每支5ml 含250mg。將5ml 環(huán)孢素A 分裝小瓶，放4℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。使用時取20μl 的原液加入50ml 的RPMI 1640 內，配成20μl/ml ，分裝0.4~0.8ml 一管，-20℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/div>
5、PHA 進口試劑、國產試劑均可， 10mg PHA, 加生理鹽水5ml 溶解， 分裝小瓶， 4℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄊ褂脻舛葹?0μg/ml ) 。
6、胎牛血清 Gibco 或Hyclone 公司生產的優(yōu)質胎牛血清， 56℃滅活30min。
7、RPMI1640 完全培養(yǎng)液的配制RPMI 1640 、15％胎牛血清、1％雙抗、18mmol/L HEPES。
8、轉化用培養(yǎng)基的配制 2ml RPMI 1640 完全培養(yǎng)液、1.2ml EB 病毒、0.4ml環(huán)孢素A、0.2mlPHA （第一次轉化使用）
9、凍存液的配制 95％的胎牛血清、5％的二甲亞砜，分裝，－20℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。使用時1ml 可用于凍存1 管。
六、小結
I、在細胞建株時，應分A 、B 兩條線進行培養(yǎng)。
2、第一次轉化時，培養(yǎng)液的pH 應為6.8~7.2 。
3、整個實驗過程均需要戴手套進行。
4、為控制污染，應用二級無菌操作柜進行。
5、在丟棄與轉化淋巴細胞及培養(yǎng)液接觸的所有材料前，必須進行消毒。
北京百歐博偉生物技術有限公司的
微生物菌種查詢網提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務,是中國微生物菌種保藏中心的服務平臺，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網站，自設設備及技術的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！
下載附件
上一篇：最新研究發(fā)現(xiàn)兒童孤獨癥譜系障礙與腸道微生物變化有關！
下一篇：慶賀！中華骨髓庫非血緣造血干細胞捐獻突破18000例！