食線蟲真菌少孢節(jié)叢孢的作用與培養(yǎng)及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-08-05 08:51:44
少孢節(jié)叢孢，殼霉目殼霉科真菌，拉丁綱名是Fungi Imperficti，中文綱名是半知菌綱，主要用途是食線蟲真菌。
菌種簡介
規(guī)格：斜面培養(yǎng)物
拉丁屬名：Arthrobotrys Oligospora
拉丁學(xué)名：Arthrobotrys oligospora
原始編號：920
菌株來源：←中國科學(xué)院微生物研究所
保藏人：劉杏忠
直接來源國家：中國
保藏時間：11/1/2004
生物危害：四類
模式菌株：非模式菌株
菌株用途：食線蟲真菌
培養(yǎng)溫度：25℃
培養(yǎng)基：0014
分離源：煙地土壤
采集地點：云南省江川漁村
采集國家：中國
提供形式：斜面培養(yǎng)物
用途：食線蟲真菌
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
（神秘的地球uux.cn報道）據(jù)EurekAlert：在生物界中，真菌作為真核生物，自成一門。真菌能夠引起植物多種病害，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。真菌還可引起動物和人類的多種疾病。真菌引起的病害難以防治，其中一個重要原因在于真菌感染的機制尚不明確；同時，真菌和感染的宿主同為真核生物，為防治增加了難度。真菌通常營多種生活方式，以此適應(yīng)各種各樣的生存環(huán)境。真菌從營腐生生活方式向寄生生活方式的轉(zhuǎn)變，與病原真菌的感染性密切相關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在少孢節(jié)叢孢轉(zhuǎn)向肉食性生活方式的過程之中，小RNA及其相關(guān)調(diào)控發(fā)揮了重要作用，為揭示真菌生活方式轉(zhuǎn)化的分子機理研究提供了新的視點。
該研究由省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室張克勤課題組完成，在線發(fā)表于《中國科學(xué)：生命科學(xué)》英文版，題目為“The lifestyle transition of Arthrobotrys oligospora is mediated by microRNA-like RNAs”。
少孢節(jié)叢孢是一種典型的捕食線蟲真菌。在土壤環(huán)境中，少孢節(jié)叢孢通常營腐生生活方式。在遭受到線蟲誘導(dǎo)的情況下，少孢節(jié)叢孢會生成特異化的捕食器官，即三維粘性菌網(wǎng)，捕捉線蟲，并隨后穿刺線蟲體壁，將其消化吸收。捕食器官的形成，是少孢節(jié)叢孢轉(zhuǎn)向肉食性生活方式的顯著標(biāo)志。線蟲，特別是植物寄生性線蟲，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中會造成巨大的經(jīng)濟損失，已經(jīng)成為最嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)病害之一。在自然界中，以少孢節(jié)叢孢為代表的捕食線蟲真菌，正是線蟲的天敵之一，為線蟲的自然防控發(fā)揮了重要作用。因此，對于少孢節(jié)叢孢的“變身”機制研究，具有非常重要的科學(xué)意義和生產(chǎn)價值。
該研究團隊利用小RNA測序和Northern雜交技術(shù)從少孢節(jié)叢孢誘導(dǎo)產(chǎn)生捕食器官過程中篩選并驗證了7個小RNA。其中，兩個小RNA的敲除會對少孢節(jié)叢孢的生活方式轉(zhuǎn)化產(chǎn)生顯著的抑制效應(yīng)。RIP分析表明，其中兩個小RNA是與QDE-2蛋白（即Ago蛋白）結(jié)合在一起發(fā)揮作用的。在這些小RNA的潛在靶標(biāo)基因中，有三個也是與QDE-2蛋白結(jié)合在一起的。有趣的是，這些靶標(biāo)基因包括了qde-2本身，而煙草表達(dá)系統(tǒng)中的體外實驗，進一步驗證了qde-2基因本身可能是被小RNA所調(diào)控。敲除qde-2基因，會對少孢節(jié)叢孢的生活方式轉(zhuǎn)化會產(chǎn)生更為深遠(yuǎn)的影響，對不同誘導(dǎo)物的反應(yīng)都被顯著地抑制了。研究表明，小RNA和RNAi機制，在少孢節(jié)叢孢誘導(dǎo)生活方式轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。
小RNA在動物和植物中廣泛存在，發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，但是在真菌中卻鮮有報道。少孢節(jié)叢孢生活方式轉(zhuǎn)化過程中的小RNA研究，進一步確認(rèn)了小RNA在真菌中的存在，為真菌“變身”機制研究提供了新的思路。
該研究得到國家基礎(chǔ)研究計劃（2013CB127500）、國家自然科學(xué)基金 （31160021，31270131，U1502262）、省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室開放課題 （2018KF003）和南京郵電大學(xué)科研基金（NY218140）的資助。
微生物培養(yǎng)方法
1、孢子制備
⑴放線菌孢子的制備
一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營養(yǎng)成分,如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。碳源和氮源不要太豐富(碳源約為1%,氮源不超過0.5%),碳源豐富容易造成生理酸性的營養(yǎng)環(huán)境,不利于放線菌孢子的形成,氮源豐富則有利于菌絲繁殖而不利于孢子形成。一般情況下,干燥和限制營養(yǎng)可直接或間接誘導(dǎo)孢子形成。放線菌斜面的培養(yǎng)溫度大多數(shù)為28 ℃,少數(shù)為37 ℃,培養(yǎng)時間為5~14天。
⑵產(chǎn)品僅限用于科研霉菌孢子的制備
霉菌的孢子培養(yǎng),一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。這是由于這些農(nóng)產(chǎn)品中的營養(yǎng)成分較適合霉菌的孢子繁殖,而且這類培養(yǎng)基的表面積較大,可獲得大量的孢子。霉菌的培養(yǎng)一般為25~28 ℃,培養(yǎng)時間為4~14天。
2、種子制備
⑴搖瓶種子制備
搖瓶種子進罐,常采用母瓶、子瓶兩級培養(yǎng),有時母瓶種子也可以直接進罐。種子培養(yǎng)基要求比較豐富和完全,并易被菌體分解利用,氮源豐富有利于菌絲生長。原則上各種營養(yǎng)成分不宜過濃,子瓶培養(yǎng)基濃度比母瓶略高,更接近種子罐的培養(yǎng)基配方。
⑵種子罐種子制備
種子罐種子制備的工藝過程,因菌種不同而異,一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。孢子(或搖瓶菌絲)被接入到體積較小的種子罐中,經(jīng)培養(yǎng)后形成大量的菌絲,這樣的種子稱為一級種子,把一級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵,稱為二級發(fā)酵。如果將一級種子接入體積較大的種子罐內(nèi),經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲,這樣制備的種子稱為二級種子,將二級種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵,稱為三級發(fā)酵。同樣道理,使用三級種子的發(fā)酵,稱為四級發(fā)酵。
保藏方法
1、傳代培養(yǎng)保藏法
又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4-6℃冰箱內(nèi)保存。
2、液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。
3、載體保藏法
是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
4、寄主保藏法
用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。
5、冷凍保藏法
可分低溫冰箱（-20-30℃，-50-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6、冷凍干燥保藏法
先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細(xì)胞懸液，以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。保護性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。
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