H22小鼠肝癌細胞的培養(yǎng)方法與操作步驟及應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-09-19 09:01:18
一、背景
H22小鼠肝癌細胞是一種常用的實驗細胞株，主要用于科學(xué)研究。這些細胞是從小鼠腹水中分離出來的，由大連醫(yī)科學(xué)院建立。H22小鼠肝癌細胞的特性包括淋巴母細胞的形態(tài)和懸浮生長的特點。它們通常用于科研目的，不適用于臨床診斷或治療。
培養(yǎng)基準備：通常使用RPMI-1640培養(yǎng)基，加入10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%的雙抗。
培養(yǎng)條件：在37攝氏度的培養(yǎng)箱中，保持95%的空氣和5%的二氧化碳，濕度為70%-80%。
凍存液：凍存液的配方通常是90%血清和10%的二甲基亞砜（DMSO）。
凍存方法：將細胞沉淀消化并離心后，加入配置好的凍存液輕輕重懸細胞，然后轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80度冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存。
復(fù)蘇方法：將凍存管在37℃水浴中迅速完全融化，然后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中離心，最后用完全培養(yǎng)基重懸細胞并接種到新的培養(yǎng)瓶中。
凍存細胞的復(fù)蘇：將凍存管在37℃水浴中迅速完全融化，然后轉(zhuǎn)移到無菌離心管中離心，最后用完全培養(yǎng)基重懸細胞并接種到新的培養(yǎng)瓶中。
細胞傳代：當細胞密度達到80%-90%時，可以進行傳代培養(yǎng)。對于懸浮細胞，傳代時可以通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細胞的生長狀態(tài)。
運輸和保存：凍存細胞通常通過干冰運輸，并在收到后立即復(fù)蘇或轉(zhuǎn)移到液氮中保存。凍存細胞轉(zhuǎn)入液氮后應(yīng)及時復(fù)蘇一管檢查凍存活性，若有異常，及時調(diào)整實驗方案。
培養(yǎng)操作：細胞培養(yǎng)需要在生物安全柜臺中進行操作，并嚴格遵守無菌操作。在培養(yǎng)液中加入適量青霉素-鏈霉素溶液以防止可能的細菌污染。
法規(guī)遵守：接收、處理、保存、丟棄及使用細胞時，要遵守相關(guān)法律法規(guī)，充分考慮可能存在的風險和責任，采取適當?shù)陌踩吞幚泶胧┍M量降低對健康或環(huán)境的危害
四、應(yīng)用
本實驗采用血清藥理學(xué)方法觀察益氣解毒中藥對體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞增殖的影響,探討益氣解毒中藥在抗肝癌治療中的作用機制,為肝癌的中醫(yī)藥治療開辟一條新的路徑。
方法：取健康大鼠10只,連續(xù)4天以1.25g/ml生藥的濃度將益氣解毒方提取液按10ml/kg的劑量灌胃,于末次給藥后1小時以0.9%戊巴比妥鈉5ml/kg腹腔注射麻醉,無菌條件下腹主動脈采血,離心、滅活、分裝、-80℃保存?zhèn)溆?以相同方法連續(xù)4天等劑量生理鹽水灌胃,制備陰性對照組血清。
將體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞分成5組：陰性對照組、陽性對照組(氟尿嘧啶)、益氣解毒中藥高、中、低劑量組。①經(jīng)倒置顯微鏡觀察各組含藥血清對體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞的生長狀態(tài)及形態(tài)的影響;②通過MTT法、CCK-8法檢測含藥血清對H22細胞增殖抑制的影響;③通過流式細胞儀法檢測含藥血清對H22細胞生長周期抑制的影響;④采用RT-PCR方法研究含藥血清對體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞增殖抑制的細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。
結(jié)果：益氣解毒中藥含藥血清對體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞的增殖在不同濃度均產(chǎn)生一定的抑制作用。①對體外培養(yǎng)的H22小鼠肝癌細胞的形態(tài)及生長狀態(tài)具有抑制作用;②對體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞增殖有抑制作用,對細胞的抑制率增高;③對體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞生長周期有抑制作用,主要表現(xiàn)在對細胞G0/G1期的抑制;④對體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞凋亡相關(guān)蛋白有一定影響,使Bcl-2表達下調(diào),Bax表達上調(diào)。
結(jié)論：通過實驗可見益氣解毒中藥含藥血清對體外培養(yǎng)H22小鼠肝癌細胞的增殖具有抑制作用。作用的機制可能與通過影響H22小鼠肝癌細胞分裂周期的G0/G1期和調(diào)節(jié)細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達有關(guān)。
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