培養(yǎng)基制備和高壓蒸汽滅菌的常見問題處理與安全注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-04-07 08:47:40
培養(yǎng)基的制備和高壓蒸汽滅菌是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中非常重要的基礎(chǔ)操作，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。以下是詳細(xì)的步驟和注意事項(xiàng)：
一、培養(yǎng)基的制備
1、材料準(zhǔn)備
試劑：根據(jù)培養(yǎng)基配方準(zhǔn)備所需化學(xué)試劑（如蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等）
容器：錐形瓶/試管（需提前清洗烘干）
工具：電子天平、量筒、pH計(jì)、磁力攪拌器
蒸餾水：確保水質(zhì)純凈（電導(dǎo)率≤5μS/cm）
2、配制流程
（1）稱量溶解：
準(zhǔn)確稱取各組分（誤差≤±2%）
先加少量水溶解高濃度成分（如牛肉膏）
難溶成分（如瓊脂）需邊加熱邊攪拌
（2）定容調(diào)pH：
定容至終體積的80%
用1mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH（滅菌后pH會(huì)下降0.2-0.3）
固體培養(yǎng)基需額外添加1.5-2%瓊脂
（3）分裝：
液體培養(yǎng)基裝量≤容器體積的2/3
斜面培養(yǎng)基分裝高度1.5-2cm
試管分裝需避免管口污染
3、特殊處理
熱敏感成分（抗生素、維生素）需過濾滅菌后添加
含碳酸氫鈉的培養(yǎng)基需CO?環(huán)境滅菌
二、高壓蒸汽滅菌
1、滅菌設(shè)備準(zhǔn)備
檢查滅菌鍋密封圈、壓力表、安全閥
確保鍋內(nèi)水位在刻度線之間（建議使用去離子水）
預(yù)運(yùn)行空載滅菌程序驗(yàn)證設(shè)備狀態(tài)
2、裝載規(guī)范
物品間距≥2cm保證蒸汽穿透
滅菌袋需使用專用透氣包裝
液體培養(yǎng)基與固體物品分鍋滅菌
滅菌指示卡置于幾何中心位置
3、滅菌程序
（1）液體培養(yǎng)基：
121℃（0.1MPa）滅菌20分鐘
含糖培養(yǎng)基需115℃滅菌15分鐘
滅菌后緩慢泄壓（防止暴沸）
（2）固體培養(yǎng)基：
121℃滅菌30分鐘
含瓊脂培養(yǎng)基需趁熱擺斜面
滅菌后需50-60℃保溫防凝固
4、滅菌效果驗(yàn)證
化學(xué)指示卡：顏色變化至標(biāo)準(zhǔn)色
生物指示劑：嗜熱脂肪芽孢桿菌測(cè)試
無菌檢測(cè)：37℃培養(yǎng)48h觀察是否渾濁
三、關(guān)鍵控制點(diǎn)
熱穿透時(shí)間：每增加100ml液體需延長(zhǎng)滅菌時(shí)間1分鐘
冷空氣排除：預(yù)排氣至壓力表指針歸零后再升壓
過熱蒸汽防護(hù)：滅菌鍋需定期校準(zhǔn)，避免溫度＞124℃
營(yíng)養(yǎng)保存：含鐵培養(yǎng)基需嚴(yán)格控制滅菌時(shí)間≤15分鐘
四、常見問題處理
滅菌不徹底：檢查蒸汽飽和度（冷空氣未排凈）
培養(yǎng)基渾濁：可能因滅菌后緩慢冷卻導(dǎo)致復(fù)溶
瓊脂不凝固：pH過低（＜5.5）或滅菌時(shí)間過長(zhǎng)
顏色異常：葡萄糖焦化（需分開滅菌糖類成分）
五、安全注意事項(xiàng)
滅菌過程需全程監(jiān)控，禁止離崗
卸壓必須自然冷卻至壓力表歸零
開啟鍋蓋時(shí)面部避開蒸汽出口
每周進(jìn)行滅菌鍋生物監(jiān)測(cè)
建議每次滅菌時(shí)記錄關(guān)鍵參數(shù)（溫度、壓力、時(shí)間、裝載量），建立完整的追溯體系。對(duì)于特殊培養(yǎng)基（如細(xì)胞培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基），應(yīng)參考ATCC或DSMZ的標(biāo)準(zhǔn)滅菌方案。
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