人扁桃體動脈內(nèi)皮細胞分離和培養(yǎng)的注意事項有哪些？
小楊 / 2025-08-20 09:15:53
人扁桃體動脈內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)對操作精度、環(huán)境控制及細胞特性維持要求較高，稍不注意可能導致細胞污染、活性降低或純度不足，以下是關鍵注意事項：
一、樣本處理與倫理規(guī)范
1、倫理與樣本質(zhì)量
必須獲得倫理委員會批準及患者知情同意，明確樣本來源的合法性（如扁桃體切除術標本需排除傳染性疾病）。
樣本需新鮮處理：扁桃體組織離體后應在 2 小時內(nèi)送至實驗室，若延遲需用含雙抗的冰冷 PBS 或培養(yǎng)基保存（4℃，不超過 6 小時），避免組織缺血壞死影響細胞活性。
2、無菌預處理
組織表面用 75% 酒精快速擦拭消毒（10-15 秒），再用含高濃度雙抗（青霉素 - 鏈霉素終濃度 200 U/mL）的 PBS 反復沖洗 3-5 次，徹底去除表面血跡、黏液及可能的微生物污染。
二、血管分離的關鍵細節(jié)
1、解剖操作
需在解剖顯微鏡下精細分離動脈：扁桃體組織中血管較細，避免誤剪或過度牽拉導致內(nèi)皮細胞損傷。
剝離動脈外膜的結締組織時，盡量保留完整的內(nèi)膜層（內(nèi)皮細胞位于內(nèi)膜最內(nèi)層），減少雜細胞（如
平滑肌細胞）混入。
2、組織塊大小
動脈段剪碎至 0.5 mm 左右為宜：過大不利于酶消化，過小可能破壞細胞完整性。
三、酶消化的控制
1、消化試劑選擇與濃度
優(yōu)先用膠原酶 Ⅰ 或 Ⅱ 型（0.1%-0.2%），避免用胰蛋白酶直接消化組織（易損傷內(nèi)皮細胞）；若后續(xù)傳代用胰酶，需嚴格控制濃度（0.25%）和時間。
消化液需預熱至 37℃，避免低溫刺激細胞。
2、消化時間把控
膠原酶消化通常 30-60 分鐘，期間每 15 分鐘輕輕震蕩一次，鏡下觀察組織塊邊緣是否松散（避免過度消化導致細胞破裂）。
終止消化需及時：加入含 10%-20% FBS 的培養(yǎng)基，通過血清中的蛋白酶抑制劑終止酶活性。
四、原代培養(yǎng)的環(huán)境優(yōu)化
1、培養(yǎng)基與添加劑
用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基或添加內(nèi)皮細胞生長因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50-100 μg/mL）的 DMEM/F12：肝素可抑制平滑肌細胞等雜細胞生長，ECGF 促進內(nèi)皮細胞增殖。
FBS 需篩選：選擇低內(nèi)毒素批次（<0.1 EU/mL），終濃度 10%-15%（過高易導致雜細胞過度生長）。
2、培養(yǎng)表面處理
培養(yǎng)皿需預包被明膠（0.1%）或纖維連接蛋白（10 μg/mL）：內(nèi)皮細胞依賴基質(zhì)貼壁，未包被表面會導致貼壁率低、細胞形態(tài)異常。
3、培養(yǎng)條件穩(wěn)定
incubator 需嚴格維持 37℃、5% CO?、濕度 95%：溫度波動 > 1℃或 CO?濃度異常會導致培養(yǎng)基 pH 值改變，影響細胞存活。
原代培養(yǎng)前 24 小時不換液：避免干擾細胞貼壁（內(nèi)皮細胞貼壁較慢，約 6-12 小時開始貼壁，24 小時后可見少量貼壁細胞）。
五、純化與雜細胞去除
1、早期污染防控
若出現(xiàn)成纖維細胞（長梭形、排列無序）或平滑肌細胞（束狀排列）污染，可在傳代時采用差速貼壁法：將細胞懸液接種到未包被的培養(yǎng)皿，30 分鐘后將未貼壁細胞（以內(nèi)皮細胞為主）轉移至新的包被皿中（成纖維細胞貼壁更快）。
避免頻繁操作：原代培養(yǎng)初期細胞脆弱，過度晃動或換液會導致細胞脫落。
2、及時換液
培養(yǎng) 48 小時后首次換液，徹底去除未貼壁的死細胞、組織碎片及酶殘留；后續(xù)每 2-3 天換液一次，保持培養(yǎng)基營養(yǎng)充足。
六、傳代與凍存注意事項
1、傳代時機與操作
細胞融合度達 80%-90% 時傳代（避免過密導致接觸抑制，影響增殖），傳代比例 1:2 為宜（過高稀釋會延長細胞恢復時間）。
胰酶消化時，鏡下觀察到細胞變圓、間隙增大即可終止（通常 1-2 分鐘），避免消化過度導致細胞膜損傷；吹打細胞時用巴氏吸管輕柔操作，減少機械損傷。
2、凍存與復蘇
凍存液配方：70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS+10% DMSO（現(xiàn)配現(xiàn)用，DMSO 需梯度降溫避免細胞結晶損傷）。
凍存過程：4℃ 30 分鐘→-20℃ 1 小時→-80℃過夜→轉入液氮（長期保存）；復蘇時 37℃水浴快速解凍（1-2 分鐘），立即加入培養(yǎng)基稀釋 DMSO，離心后重懸接種。
七、細胞鑒定與質(zhì)量控制
純度驗證
傳代 2-3 次后需鑒定：通過免疫熒光檢測 CD31、vWF 等內(nèi)皮細胞特異性標志物（陽性率需≥95%），排除雜細胞污染。
功能驗證：進行管腔形成實驗，確認細胞功能正常。
八、其他注意事項
操作全程避免引入氣泡：氣泡會破壞細胞貼壁環(huán)境，導致局部細胞死亡。
避免頻繁觀察：減少培養(yǎng)箱開門次數(shù)，維持穩(wěn)定的溫濕度和 CO?濃度。
傳代限制：原代內(nèi)皮細胞通常傳至 5-6 代后會出現(xiàn)衰老、功能下降，建議在 3-4 代內(nèi)使用，或早期凍存保種。
通過嚴格把控以上環(huán)節(jié)，可顯著提高
人扁桃體動脈內(nèi)皮細胞的分離成功率、純度及活性，為后續(xù)實驗研究提供可靠的細胞模型。
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