必須獲得倫理委員會批準(zhǔn)及患者知情同意，明確樣本來源的合法性（如扁桃體切除術(shù)標(biāo)本需排除傳染性疾?。?/div>
樣本需新鮮處理：扁桃體組織離體后應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，若延遲需用含雙抗的冰冷 PBS 或培養(yǎng)基保存（4℃，不超過 6 小時(shí)），避免組織缺血壞死影響細(xì)胞活性。
2、無菌預(yù)處理
組織表面用 75% 酒精快速擦拭消毒（10-15 秒），再用含高濃度雙抗（青霉素 - 鏈霉素終濃度 200 U/mL）的 PBS 反復(fù)沖洗 3-5 次，徹底去除表面血跡、黏液及可能的微生物污染。
二、血管分離的關(guān)鍵細(xì)節(jié)
1、解剖操作
需在解剖顯微鏡下精細(xì)分離動(dòng)脈：扁桃體組織中血管較細(xì)，避免誤剪或過度牽拉導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
剝離動(dòng)脈外膜的結(jié)締組織時(shí)，盡量保留完整的內(nèi)膜層（內(nèi)皮細(xì)胞位于內(nèi)膜最內(nèi)層），減少雜細(xì)胞（如
平滑肌細(xì)胞）混入。
2、組織塊大小
動(dòng)脈段剪碎至 0.5 mm 左右為宜：過大不利于酶消化，過小可能破壞細(xì)胞完整性。
三、酶消化的控制
1、消化試劑選擇與濃度
優(yōu)先用膠原酶 Ⅰ 或 Ⅱ 型（0.1%-0.2%），避免用胰蛋白酶直接消化組織（易損傷內(nèi)皮細(xì)胞）；若后續(xù)傳代用胰酶，需嚴(yán)格控制濃度（0.25%）和時(shí)間。
消化液需預(yù)熱至 37℃，避免低溫刺激細(xì)胞。
2、消化時(shí)間把控
膠原酶消化通常 30-60 分鐘，期間每 15 分鐘輕輕震蕩一次，鏡下觀察組織塊邊緣是否松散（避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞破裂）。
終止消化需及時(shí)：加入含 10%-20% FBS 的培養(yǎng)基，通過血清中的蛋白酶抑制劑終止酶活性。
四、原代培養(yǎng)的環(huán)境優(yōu)化
1、培養(yǎng)基與添加劑
用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基或添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50-100 μg/mL）的 DMEM/F12：肝素可抑制平滑肌細(xì)胞等雜細(xì)胞生長，ECGF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
FBS 需篩選：選擇低內(nèi)毒素批次（<0.1 EU/mL），終濃度 10%-15%（過高易導(dǎo)致雜細(xì)胞過度生長）。
2、培養(yǎng)表面處理
培養(yǎng)皿需預(yù)包被明膠（0.1%）或纖維連接蛋白（10 μg/mL）：內(nèi)皮細(xì)胞依賴基質(zhì)貼壁，未包被表面會導(dǎo)致貼壁率低、細(xì)胞形態(tài)異常。
3、培養(yǎng)條件穩(wěn)定
incubator 需嚴(yán)格維持 37℃、5% CO?、濕度 95%：溫度波動(dòng) > 1℃或 CO?濃度異常會導(dǎo)致培養(yǎng)基 pH 值改變，影響細(xì)胞存活。
原代培養(yǎng)前 24 小時(shí)不換液：避免干擾細(xì)胞貼壁（內(nèi)皮細(xì)胞貼壁較慢，約 6-12 小時(shí)開始貼壁，24 小時(shí)后可見少量貼壁細(xì)胞）。
五、純化與雜細(xì)胞去除
1、早期污染防控
若出現(xiàn)成纖維細(xì)胞（長梭形、排列無序）或平滑肌細(xì)胞（束狀排列）污染，可在傳代時(shí)采用差速貼壁法：將細(xì)胞懸液接種到未包被的培養(yǎng)皿，30 分鐘后將未貼壁細(xì)胞（以內(nèi)皮細(xì)胞為主）轉(zhuǎn)移至新的包被皿中（成纖維細(xì)胞貼壁更快）。
避免頻繁操作：原代培養(yǎng)初期細(xì)胞脆弱，過度晃動(dòng)或換液會導(dǎo)致細(xì)胞脫落。
2、及時(shí)換液
培養(yǎng) 48 小時(shí)后首次換液，徹底去除未貼壁的死細(xì)胞、組織碎片及酶殘留；后續(xù)每 2-3 天換液一次，保持培養(yǎng)基營養(yǎng)充足。
六、傳代與凍存注意事項(xiàng)
1、傳代時(shí)機(jī)與操作
細(xì)胞融合度達(dá) 80%-90% 時(shí)傳代（避免過密導(dǎo)致接觸抑制，影響增殖），傳代比例 1:2 為宜（過高稀釋會延長細(xì)胞恢復(fù)時(shí)間）。
胰酶消化時(shí)，鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大即可終止（通常 1-2 分鐘），避免消化過度導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷；吹打細(xì)胞時(shí)用巴氏吸管輕柔操作，減少機(jī)械損傷。
2、凍存與復(fù)蘇
凍存液配方：70% 培養(yǎng)基 + 20% FBS+10% DMSO（現(xiàn)配現(xiàn)用，DMSO 需梯度降溫避免細(xì)胞結(jié)晶損傷）。
凍存過程：4℃ 30 分鐘→-20℃ 1 小時(shí)→-80℃過夜→轉(zhuǎn)入液氮（長期保存）；復(fù)蘇時(shí) 37℃水浴快速解凍（1-2 分鐘），立即加入培養(yǎng)基稀釋 DMSO，離心后重懸接種。
七、細(xì)胞鑒定與質(zhì)量控制
純度驗(yàn)證
傳代 2-3 次后需鑒定：通過免疫熒光檢測 CD31、vWF 等內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物（陽性率需≥95%），排除雜細(xì)胞污染。
功能驗(yàn)證：進(jìn)行管腔形成實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)細(xì)胞功能正常。
八、其他注意事項(xiàng)
操作全程避免引入氣泡：氣泡會破壞細(xì)胞貼壁環(huán)境，導(dǎo)致局部細(xì)胞死亡。
避免頻繁觀察：減少培養(yǎng)箱開門次數(shù)，維持穩(wěn)定的溫濕度和 CO?濃度。
傳代限制：原代內(nèi)皮細(xì)胞通常傳至 5-6 代后會出現(xiàn)衰老、功能下降，建議在 3-4 代內(nèi)使用，或早期凍存保種。
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