如何篩選具有高效防病促生作用的皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌株？
小楊 / 2025-08-25 08:55:23
一、篩選前準備：明確核心目標與關鍵指標
在篩選前需定義“高效”的量化標準，避免盲目篩選。參考農業(yè)應用需求，核心指標如下：
功能類型 關鍵指標（量化標準） 備注
高效防病 1.對目標病害的離體抑菌率≥70%；2.活體盆栽防效≥60%；3.能穩(wěn)定產生抑菌物質 需覆蓋 1-2 種主要靶標致病菌
高效促生 1.產生長素≥50 μg/mL；2.固氮能力≥10 mg N/g 底物；3.溶磷量≥200 μg/mL； 促生指標需結合目標作物的需求
實用性 1.生長溫度適應范圍廣；2.耐酸堿、耐低鹽；3.傳代 5 次后功能保留率≥80% 確保菌株能適應田間環(huán)境及工業(yè)化生產
二、第一步：菌株分離純化 —— 從“高潛力生境”富集目標菌
皮爾瑞俄類芽胞桿菌多存在于植物根際土壤、健康植物組織（內生）、病害發(fā)生區(qū)的抗病植株根際（長期自然選擇下易富集抗病菌株），需優(yōu)先從這些生境采樣，提高篩選效率。
1、樣品采集
采樣生境：優(yōu)先選擇 3 類場景：
連作障礙田（如黃瓜、番茄田）中“健康植株根際土”（可能富集拮抗病原菌的菌株）；
已發(fā)生目標病害的田塊中“抗病單株的根際 / 莖稈內生”（菌株可能已形成對病原菌的競爭優(yōu)勢）；
有機種植田的作物根際（減少化學農藥對菌株的抑制，保留多樣功能菌）。
采樣方法：根際土需取“植株根系附著的 0-10 cm 表層土”，去除雜質后裝無菌袋；內生菌需取莖稈 / 根系，表面消毒（75% 乙醇 30s→0.1% HgCl? 1min→無菌水沖洗 3 次）后研磨。
2、分離純化（基于生理特性的選擇性富集）
利用
皮爾瑞俄類芽胞桿菌“好氧、耐一定溫度、革蘭氏陽性”的特性，通過選擇性培養(yǎng)基 + 溫度脅迫排除雜菌：
富集培養(yǎng)：將樣品（根際土 10g / 內生組織研磨液）加入含 100mL NA 培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂） 的三角瓶，30℃、180rpm 振蕩培養(yǎng) 24h（好氧富集）；之后取 1mL 培養(yǎng)液，在 80℃水浴中處理 10min（殺死非芽胞菌，保留類芽胞桿菌的芽胞）。
稀釋涂布：將熱處理后的菌液梯度稀釋（10??~10??），取 0.1mL 涂布于PA 培養(yǎng)基（選擇性培養(yǎng)基，含 5μg/mL 氨芐青霉素，抑制革蘭氏陰性菌） ，30℃倒置培養(yǎng) 48h。
單菌落純化：觀察菌落形態(tài)（皮爾瑞俄類芽胞桿菌典型菌落：圓形、表面光滑、乳白色、邊緣整齊，直徑 2-3mm），挑取符合形態(tài)的單菌落，在 NA 平板上劃線純化 3 次，獲得純菌株。
三、第二步：初篩 —— 快速排除無功能菌株（低成本、高通量）
初篩以“表型特征 + 基礎功能”為核心，通過簡單實驗快速篩選出具有“防病 / 促生潛力”的菌株，減少后續(xù)復篩的工作量。
1、菌株身份驗證：排除非目標菌
初篩階段需先確認菌株為Paenibacillus peoriae，避免錯篩：
形態(tài)與生理驗證：革蘭氏染色（陽性，桿狀）、鞭毛染色（周生多鞭毛）、運動性觀察（半固體培養(yǎng)基穿刺，可見擴散生長）；
分子鑒定：提取菌株基因組 DNA，擴增16S rRNA 基因（通用引物 27F/1492R）和類芽胞桿菌屬特異性基因gyrB（引物 gyrB-F/gyrB-R），測序后與 NCBI 數據庫中P. peoriae 模式菌株比對，同源性≥99% 可確認為目標菌。
2、防病潛力初篩：離體抑菌實驗（高通量）
采用“平板對峙法 / 抑菌圈法”，快速檢測菌株對靶標病原菌的拮抗能力：
靶標病原菌選擇：根據目標作物確定，如針對蔬菜可選：
細菌性病原菌：黃瓜細菌性軟腐病菌（Erwinia carotovora）、番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）；
真菌性病原菌：黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）。
實驗方法：
平板對峙法：在 PDA 平板中央接種病原菌菌餅（直徑 5mm），距中央 2.5cm 處接種純化的皮爾瑞俄類芽胞桿菌（點接，直徑 2mm），30℃培養(yǎng) 3-5d，測量“抑菌圈寬度”（病原菌菌落與細菌菌落間的空白距離），寬度≥5mm 為有潛力菌株；
抑菌圈法：將病原菌菌懸液（10? CFU/mL）均勻涂布于 PDA/NA 平板，放置無菌牛津杯（直徑 8mm），加入 100μL 皮爾瑞俄類芽胞桿菌發(fā)酵液（30℃振蕩培養(yǎng) 48h，離心取上清），培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑，直徑≥15mm 為高效潛力菌株。
3、促生潛力初篩：基礎促生特性檢測
針對“產 IAA、固氮、溶磷”3 個核心促生功能，采用定性 / 半定量方法初篩：
產 IAA 檢測（Salkowski 比色法）：將菌株接種于含 L - 色氨酸（1g/L）的 LB 液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng) 48h，取上清 1mL+2mL Salkowski 試劑（50mL 35% HClO? + 1mL 0.5mol/L FeCl?），避光反應 30min，若溶液呈粉紅色，說明產 IAA（顏色越深，產量越高）；
固氮能力檢測（無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)）：將菌株接種于Ashby 無氮培養(yǎng)基（不含氮源，僅含碳源和礦物質），30℃培養(yǎng) 7d，能正常生長（菌落直徑≥2mm）說明具有固氮潛力；
溶磷能力檢測（溶磷圈法）：將菌株接種于Pikovaskaia 溶磷培養(yǎng)基（含難溶性磷酸鈣，pH 7.0），30℃培養(yǎng) 7d，觀察菌落周圍是否出現透明溶磷圈，計算“溶磷圈直徑 / 菌落直徑比值（D/d）”，比值≥2.0 為高效溶磷潛力菌株。
四、第三步：復篩 —— 精準量化功能，篩選“高效菌株”
初篩獲得的菌株需通過定量檢測 + 活體驗證，排除“離體有效、活體無效”或“功能不穩(wěn)定”的菌株，核心是“量化高效性 + 驗證穩(wěn)定性”。
1、防病功能復篩：從“離體”到“活體”，驗證實際防效
第一步：抑菌物質定量與類型分析
對初篩高抑菌活性菌株，發(fā)酵后通過“高效液相色譜（HPLC）”檢測其特征抑菌物質的含量（參考標準品峰面積定量），同時通過“蛋白酶 K 處理發(fā)酵液”（若抑菌活性下降，說明抑菌物質含蛋白質 / 多肽）、“酸堿處理（pH 2-10）”（驗證抑菌物質穩(wěn)定性），確保菌株能穩(wěn)定產抑菌物質。
第二步：活體盆栽防效實驗
以目標作物（如黃瓜、番茄）為材料，分 3 組處理：
對照組：僅接種病原菌；
菌株處理組：先灌根 / 噴霧皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌懸液（10? CFU/mL），24h 后接種病原菌；
空白組：不接菌。
培養(yǎng) 15-20d 后，統(tǒng)計“病株率”“病情指數”，計算防效 =（對照組病情指數 - 處理組病情指數）/ 對照組病情指數 ×100% ，防效≥60% 為高效防病菌株。
2、促生功能復篩：從“實驗室指標”到“植物表型”，驗證促生實效
第一步：促生物質定量檢測
對初篩陽性菌株，采用“高效液相色譜（HPLC）”精準定量 IAA 產量（需用 IAA 標準品繪制標準曲線）；采用“鉬藍比色法”定量溶磷量（檢測發(fā)酵液中可溶性磷含量）；采用“凱氏定氮法”定量固氮量（檢測無氮培養(yǎng)基中菌株固定的氮含量），確保指標達到“高效”標準。
第二步：活體促生實驗
以無菌基質（如蛭石 + 珍珠巖 = 3:1）培養(yǎng)目標作物（如玉米、黃瓜），分 2 組處理：
處理組：每株灌根 10mL 皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌懸液（10? CFU/mL）；
對照組：灌根 10mL 無菌培養(yǎng)基。
培養(yǎng) 20-30d 后，測定“株高、根長、地上部鮮重、地下部鮮重”，計算促生率 =（處理組指標 - 對照組指標）/ 對照組指標 ×100% ，至少 2 項指標促生率≥20% 為高效促生菌株。
3、環(huán)境適應性與遺傳穩(wěn)定性驗證
環(huán)境適應性：將菌株接種于不同條件的 NA 培養(yǎng)基（溫度 5/15/30/40℃；pH 5.0/6.0/7.0/8.0；NaCl 濃度 1%/2%/3%），培養(yǎng) 48h 后測 OD???（菌體濃度），確保在多數農田環(huán)境下（如低溫 15℃、pH 6-8）能正常生長（OD???≥1.0）；
遺傳穩(wěn)定性：將菌株連續(xù)傳代 10 次，每次傳代后檢測“抑菌率”“IAA 產量”，若功能保留率≥80%，說明遺傳穩(wěn)定（避免工業(yè)化生產中功能丟失）。
五、第四步：綜合評價與篩選 —— 確定最終高效菌株
通過上述步驟后，需對菌株進行多維度綜合評分，篩選出“防病 - 促生 - 適應性”均優(yōu)的菌株，評分標準參考如下：
評價維度 權重 評分標準（100 分制）
防病能力 30% 活體防效≥70%（30 分）；60-70%（20 分）；<60%（0 分）
促生能力 30% 2 項指標促生率≥25%（30 分）；1 項≥25%+1 項≥20%（20 分）；<20%（0 分）
環(huán)境適應性 20% 40℃/pH 5.0/3% NaCl 下均能生長（20 分）；2 項達標（10 分）；1 項達標（5 分）
遺傳穩(wěn)定性 20% 傳代 10 次功能保留率≥90%（20 分）；80-90%（10 分）；<80%（0 分）
最終篩選標準：綜合評分≥80 分，且至少對 1 種靶標病害防效≥60%、1 項促生指標≥25% 的菌株，即為“高效防病促生皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌株”。
六、關鍵注意事項
多生境采樣：至少采集 5-10 個不同生境的樣品，增加菌株多樣性，提高篩選到“高效菌株”的概率；
多靶點篩選：防病需覆蓋“細菌 + 真菌”類病原菌，促生需檢測“產 IAA + 固氮 / 溶磷”，避免菌株功能單一；
結合實際應用場景：若目標是“低溫地區(qū)農田”，需強化菌株的低溫生長能力（5-15℃）篩選；若用于“鹽堿地”，需提高耐鹽（≥3% NaCl）篩選標準；
分子輔助篩選：可通過 PCR 擴增“抑菌基因（如脂肽合成基因fenD）”或“促生基因”，快速預判菌株功能，縮短篩選周期。
通過以上流程，可系統(tǒng)性篩選出兼具“高效性、穩(wěn)定性、實用性”的
皮爾瑞俄類芽胞桿菌菌株，為后續(xù)農業(yè)應用（如生物菌劑研發(fā)）提供核心菌種資源。
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