小鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的基本特性與培養(yǎng)方法及研究應(yīng)用！
小楊 / 2025-08-27 09:46:36
小鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（Mouse Coronary Artery Endothelial Cells, MCAECs）是位于小鼠冠狀動(dòng)脈血管壁最內(nèi)層的單層扁平上皮細(xì)胞，是維持冠狀動(dòng)脈正常生理功能、調(diào)節(jié)心肌血流灌注的關(guān)鍵細(xì)胞類型，也是心血管疾病研究中的重要體外模型。以下從細(xì)胞基本特性、分離培養(yǎng)方法、研究應(yīng)用、關(guān)鍵注意事項(xiàng)四個(gè)維度展開(kāi)詳細(xì)說(shuō)明，為科研實(shí)驗(yàn)提供參考。
一、細(xì)胞基本特性
MCAECs 兼具血管內(nèi)皮細(xì)胞的通用特征，同時(shí)因所處“冠狀動(dòng)脈微環(huán)境”（需耐受心肌收縮壓力、維持心肌高氧供需求）而具有獨(dú)特表型和功能：
1、形態(tài)學(xué)特征
典型形態(tài)：貼壁培養(yǎng)時(shí)呈鵝卵石樣單層排列，細(xì)胞扁平、形態(tài)規(guī)則，胞核清晰居中（圓形或橢圓形），邊緣可見(jiàn)輕微突起（與相鄰細(xì)胞形成連接）；
特異性結(jié)構(gòu)：胞膜表面富含血管內(nèi)皮鈣黏蛋白形成的緊密連接（維持血管屏障功能），胞質(zhì)內(nèi)含有小體（儲(chǔ)存血管性血友病因子 vWF，參與凝血調(diào)節(jié)），部分細(xì)胞可見(jiàn)微小窗孔（適應(yīng)心肌代謝對(duì)物質(zhì)交換的高需求）。
2、核心表型標(biāo)志物（鑒定依據(jù)）
MCAECs 的特異性標(biāo)志物是實(shí)驗(yàn)中確認(rèn)細(xì)胞純度的關(guān)鍵，需通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證，常用標(biāo)志物如下：
標(biāo)志物類型 具體分子 功能與鑒定意義
通用內(nèi)皮標(biāo)志物 血管性血友病因子 內(nèi)皮細(xì)胞特異性分泌蛋白，小體的核心成分，陽(yáng)性率需≥95%（排除非內(nèi)皮細(xì)胞污染）
血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子 跨膜黏附蛋白，參與細(xì)胞間連接，幾乎所有內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)，可作為內(nèi)皮細(xì)胞的 “通用標(biāo)簽”
血管床特異性標(biāo)志物 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，催化生成 NO（調(diào)節(jié)血管舒張，維持心肌血流）
血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM） 細(xì)胞膜表面抗凝蛋白，冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)，可排除平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞污染
陰性對(duì)照標(biāo)志物 α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白 平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物，MCAECs 應(yīng)呈陰性（若陽(yáng)性提示平滑肌細(xì)胞污染，需進(jìn)一步純化）
3、主要生理功能
MCAECs 的功能直接關(guān)聯(lián)冠狀動(dòng)脈健康和心肌供血，核心功能包括：
屏障功能：通過(guò) VE-cadherin 介導(dǎo)的緊密連接，維持血管壁完整性，阻止血液中大分子物質(zhì)（如脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞）異常滲透至血管壁（預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化起始）；
血管舒縮調(diào)節(jié)：通過(guò) eNOS 生成一氧化氮（NO），激活平滑肌細(xì)胞內(nèi) cGMP 通路，導(dǎo)致血管舒張，調(diào)節(jié)冠狀動(dòng)脈血流量（適應(yīng)心肌在運(yùn)動(dòng)、缺血時(shí)的氧供需求）；
抗凝與抗炎：表達(dá) TM、蛋白 C 受體等抗凝分子，抑制凝血酶激活；分泌前列環(huán)素，抑制血小板聚集；同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)黏附分子表達(dá)，控制炎癥細(xì)胞黏附（減少心肌炎癥損傷）；
物質(zhì)交換：通過(guò)細(xì)胞膜窗孔和載體蛋白，介導(dǎo)血液與心肌細(xì)胞間的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、脂肪酸）及代謝廢物（如乳酸）交換，維持心肌正常代謝。
二、細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法（常用流程）
MCAECs 的分離需兼顧“高純度”和“高活性”，核心是通過(guò)酶解消化冠狀動(dòng)脈組織、排除雜細(xì)胞污染，以下為經(jīng)典的小鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟（適用于 C57BL/6 等常用近交系小鼠）：
1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
動(dòng)物：選擇 6-8 周齡健康小鼠（雌雄均可，體重 20-25g，避免老年小鼠，因血管彈性下降導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活力降低）；
試劑：
消化液：0.1% 膠原酶 II（Sigma，需用無(wú)血清 DMEM 稀釋，37℃預(yù)熱）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA（僅用于后續(xù)雜細(xì)胞去除）；
培養(yǎng)基：內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（如 ECGM，添加 5% 胎牛血清 FBS、1% 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ECGS、1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗，避免使用含高濃度血清的培養(yǎng)基，防止成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖）；
其他：無(wú)菌 PBS（pH7.2-7.4）、4% 多聚甲醛（固定細(xì)胞）、無(wú)菌手術(shù)器械（顯微剪刀、鑷子、血管夾）。
器材：超凈工作臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2，濕度 95%）、倒置顯微鏡、離心管（15mL/50mL）、培養(yǎng)皿（6 孔 / 12 孔，提前用明膠包被：0.1% 明膠溶液室溫孵育 30 分鐘，棄去后晾干，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁能力）。
2、分離步驟（關(guān)鍵：精準(zhǔn)獲取冠狀動(dòng)脈組織）
小鼠心臟取材：
小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死（需符合動(dòng)物倫理規(guī)范），75% 乙醇浸泡消毒 5 分鐘；
無(wú)菌條件下開(kāi)胸，暴露心臟，用血管夾夾住主動(dòng)脈根部，快速剪下心臟（避免損傷冠狀動(dòng)脈主干），放入預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 中（洗去表面血液）。
冠狀動(dòng)脈灌注與酶解：
將心臟固定于灌注裝置上，從主動(dòng)脈根部緩慢注入 37℃預(yù)熱的 0.1% 膠原酶 II 溶液（灌注壓力控制在 80-100mmHg，避免壓力過(guò)高損傷內(nèi)皮細(xì)胞），同時(shí)用顯微鏡觀察冠狀動(dòng)脈分支是否充盈（當(dāng)血管呈半透明狀時(shí)，提示酶液已充分滲透）；
灌注后，將心臟放入含膠原酶 II 的離心管中，37℃水浴振蕩消化 15-20 分鐘（每隔 5 分鐘輕輕吹打 1 次，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落）。
細(xì)胞收集與純化：
消化結(jié)束后，加入等體積含 FBS 的 ECGM 培養(yǎng)基終止消化，用 100μm 細(xì)胞篩過(guò)濾（去除未消化的組織碎片），收集濾液；
1000rpm 離心 5 分鐘，棄上清，用 ECGM 重懸細(xì)胞，接種至明膠包被的 6 孔板中，37℃ CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 小時(shí)（此時(shí)雜細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞也會(huì)貼壁）；
24 小時(shí)后，用無(wú)菌 PBS 輕輕洗板 2 次（去除未貼壁的死細(xì)胞），更換新鮮 ECGM；待細(xì)胞融合至 70% 時(shí)，加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 消化 30 秒（內(nèi)皮細(xì)胞貼壁較松，優(yōu)先脫落，而平滑肌細(xì)胞貼壁緊密，可通過(guò)短時(shí)間消化實(shí)現(xiàn)初步純化）；
收集脫落的細(xì)胞，再次接種至新的明膠包被板中，繼續(xù)培養(yǎng)（若需更高純度，可采用免疫磁珠分選法：用 CD31 抗體偶聯(lián)的磁珠，特異性捕獲 CD31 + 內(nèi)皮細(xì)胞，純度可達(dá) 98% 以上）。
3、培養(yǎng)與傳代注意事項(xiàng)
傳代時(shí)機(jī)：當(dāng)細(xì)胞融合至 80-90% 時(shí)進(jìn)行傳代（避免過(guò)度融合導(dǎo)致細(xì)胞分化，失去內(nèi)皮細(xì)胞特性），傳代比例為 1:2（每瓶傳 2 瓶，密度過(guò)低易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡）；
培養(yǎng)基更換：常規(guī)每 2-3 天更換 1 次 ECGM，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基變黃（pH 下降）或有污染跡象（如出現(xiàn)漂浮物、培養(yǎng)基渾濁），需立即更換；
細(xì)胞狀態(tài)觀察：正常 MCAECs 呈鵝卵石樣排列，若出現(xiàn)梭形細(xì)胞增多、eNOS 表達(dá)下降，提示細(xì)胞已老化或分化，需棄用（建議傳代次數(shù)不超過(guò) 5 代，超過(guò) 5 代后細(xì)胞功能易丟失）。
三、主要研究應(yīng)用
MCAECs 因與人類冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能高度相似，且小鼠模型可通過(guò)基因編輯實(shí)現(xiàn)特定基因調(diào)控，成為心血管領(lǐng)域的核心研究工具，主要應(yīng)用場(chǎng)景如下：
1、動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究
模擬人類冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的起始過(guò)程：在體外培養(yǎng)體系中加入氧化低密度脂蛋白，觀察 MCAECs 的屏障功能變化、炎癥黏附分子表達(dá)上調(diào)情況，探索脂質(zhì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的分子機(jī)制；
基因功能驗(yàn)證：利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除 MCAECs 中的候選基因，觀察細(xì)胞對(duì) ox-LDL 的攝取能力及炎癥反應(yīng)變化，明確該基因在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。
2、心肌缺血再灌注損傷（IRI）研究
體外模擬缺血環(huán)境：將 MCAECs 置于低氧培養(yǎng)箱（1% O2）中培養(yǎng) 4 小時(shí)（模擬缺血），再恢復(fù)正常氧濃度（21% O2）培養(yǎng) 2 小時(shí)（模擬再灌注），構(gòu)建缺血再灌注模型；
研究細(xì)胞損傷機(jī)制：檢測(cè)模型中 MCAECs 的凋亡率、NO 生成量（eNOS 活性變化）、氧化應(yīng)激水平（ROS 檢測(cè)），探索再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵通路，同時(shí)篩選保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的藥物。
3、高血壓相關(guān)血管重構(gòu)研究
模擬高血壓環(huán)境：用血管緊張素 II（Ang II）處理 MCAECs，觀察細(xì)胞增殖、遷移能力變化，以及細(xì)胞外基質(zhì)（如膠原 I、纖連蛋白）的分泌情況，探索高血壓導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈壁增厚、管腔狹窄的內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制；
驗(yàn)證降壓藥物的內(nèi)皮保護(hù)作用：檢測(cè)降壓藥對(duì) Ang II 誘導(dǎo)的 MCAECs 功能異常的逆轉(zhuǎn)效果，為藥物研發(fā)提供體外數(shù)據(jù)支持。
4、血管生成與心肌修復(fù)研究
體外血管生成實(shí)驗(yàn)：將 MCAECs 接種至 Matrigel 基質(zhì)膠上，觀察細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)的能力（血管生成的關(guān)鍵指標(biāo)），研究促血管生成因子對(duì) MCAECs 的調(diào)控作用；
心肌梗死修復(fù)研究：將體外培養(yǎng)的 MCAECs 與干細(xì)胞（如
間充質(zhì)干細(xì)胞）共培養(yǎng)，觀察干細(xì)胞對(duì) MCAECs 血管生成能力的影響，為心肌梗死術(shù)后的血管再生治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（確保實(shí)驗(yàn)可靠性）
1、細(xì)胞純度鑒定是前提：
每批次分離的 MCAECs 必須通過(guò)免疫熒光驗(yàn)證 vWF、CD31、eNOS 的陽(yáng)性率（需≥95%），同時(shí)確認(rèn) α-SMA 陰性（排除平滑肌細(xì)胞污染），否則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差（如雜細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子干擾內(nèi)皮細(xì)胞功能檢測(cè)）。
2、避免細(xì)胞活化或損傷：
分離過(guò)程中需嚴(yán)格控制酶解時(shí)間和溫度（膠原酶消化超過(guò) 25 分鐘會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降），灌注壓力需穩(wěn)定（壓力過(guò)高會(huì)破壞內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接）；
培養(yǎng)過(guò)程中避免反復(fù)操作（如頻繁換液、劇烈吹打），防止細(xì)胞活化（如異常表達(dá)，模擬炎癥狀態(tài)，影響基礎(chǔ)功能檢測(cè)）。
3、實(shí)驗(yàn)分組與對(duì)照設(shè)計(jì)：
需設(shè)置空白對(duì)照（未處理的 MCAECs）、陰性對(duì)照（僅加溶劑，如 PBS）、陽(yáng)性對(duì)照（已知作用的藥物，如用 VEGF 作為促血管生成陽(yáng)性對(duì)照），確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性；
若使用基因編輯小鼠的 MCAECs，需同時(shí)設(shè)置野生型小鼠的 MCAECs 作為對(duì)照，排除遺傳背景差異的影響。
4、倫理與安全規(guī)范：
小鼠實(shí)驗(yàn)需經(jīng)機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（遵循 3R 原則：替代、減少、優(yōu)化），處死過(guò)程需符合無(wú)痛化要求；
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免支原體、細(xì)菌污染（可定期用支原體檢測(cè)試劑盒排查，污染的細(xì)胞需立即滅活處理，不可隨意丟棄）。
五、總結(jié)
小鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞是研究冠狀動(dòng)脈生理功能及心血管疾病機(jī)制的“理想體外模型”，其分離培養(yǎng)的核心是“精準(zhǔn)獲取組織 + 高效純化 + 維持細(xì)胞表型”，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中需結(jié)合具體研究方向（如動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷）設(shè)計(jì)合理的模型，并通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)控（純度鑒定、對(duì)照設(shè)置）確保結(jié)果的可靠性。同時(shí)，需注意小鼠與人類冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的差異（如小鼠冠狀動(dòng)脈分支更細(xì)，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)可能存在物種差異），實(shí)驗(yàn)結(jié)論需結(jié)合體內(nèi)模型進(jìn)一步驗(yàn)證。
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