微生物實(shí)驗(yàn)室傳代過程中如何保證培養(yǎng)條件的穩(wěn)定性？
小楊 / 2025-09-25 09:36:31
百歐博偉生物：傳代過程中保證培養(yǎng)條件穩(wěn)定，核心是對(duì)溫度、pH 值、氧氣、營(yíng)養(yǎng)、無(wú)菌環(huán)境這五大關(guān)鍵因素進(jìn)行“標(biāo)準(zhǔn)化控制”，通過固定操作流程和使用專用設(shè)備，避免環(huán)境波動(dòng)誘發(fā)菌種代謝異?；蛩ネ?。
一、溫度：精準(zhǔn)控制，避免波動(dòng)
溫度是影響微生物酶活性和代謝速率的核心因素，微小波動(dòng)都可能導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)異常，需從“培養(yǎng)環(huán)境”和“操作過程”雙端把控。
1、固定培養(yǎng)溫度，使用精準(zhǔn)控溫設(shè)備
優(yōu)先使用恒溫培養(yǎng)箱（精度 ±0.5℃）或水浴搖床（適用于液體培養(yǎng)），并提前 1 小時(shí)預(yù)熱至目標(biāo)溫度（如
大腸桿菌 37℃、
酵母菌 28℃），待溫度穩(wěn)定后再放入菌種。
避免使用精度低的普通烤箱或室溫培養(yǎng)，尤其在季節(jié)交替或空調(diào)環(huán)境下，室溫波動(dòng)可能超過 ±2℃，極易導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)緩慢或形態(tài)改變。
2、減少操作過程中的溫度暴露
從培養(yǎng)箱中取出菌種進(jìn)行接種時(shí)，動(dòng)作需快速（單次暴露時(shí)間不超過 5 分鐘），避免培養(yǎng)基或菌種在室溫下放置過久。
接種用的培養(yǎng)基（如斜面、平板）需提前在培養(yǎng)箱中預(yù)熱至目標(biāo)溫度，避免冷的培養(yǎng)基接觸菌種后，瞬間降低局部溫度。
二、pH 值：提前調(diào)節(jié)，全程穩(wěn)定
微生物對(duì) pH 值極其敏感，過酸或過堿會(huì)直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，需在培養(yǎng)基制備階段就固定 pH 值，并通過添加緩沖劑維持全程穩(wěn)定。
1、培養(yǎng)基制備時(shí)精準(zhǔn)調(diào)節(jié) pH
使用pH 計(jì)（而非 pH 試紙，精度更高）在滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 至菌種最適范圍（如細(xì)菌 7.0-7.2、放線菌 7.5-8.0、酵母菌 4.5-5.5）。
注意：滅菌后培養(yǎng)基 pH 可能會(huì)下降 0.1-0.3（如含糖培養(yǎng)基滅菌后易產(chǎn)酸），因此滅菌前可將 pH 適當(dāng)調(diào)高 0.2，抵消滅菌后的變化。
2、添加緩沖劑，抵抗 pH 波動(dòng)
根據(jù)菌種代謝特性添加緩沖物質(zhì)，例如：
培養(yǎng)產(chǎn)酸菌種（如乳酸菌）時(shí)，在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣（1%-2%）或磷酸氫二鉀 / 磷酸二氫鉀緩沖對(duì)（濃度 0.05mol/L），中和代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，維持 pH 穩(wěn)定。
培養(yǎng)產(chǎn)堿菌種時(shí)，可添加少量檸檬酸或琥珀酸，平衡堿性代謝產(chǎn)物。
三、氧氣：按需供給，避免不足或過量
不同菌種對(duì)氧氣需求差異極大（需氧、厭氧、兼性厭氧），氧氣供給不當(dāng)會(huì)直接導(dǎo)致菌種活力下降，需通過專用培養(yǎng)設(shè)備和操作方式控制。
菌種類型 氧氣控制方法 關(guān)鍵操作要點(diǎn)
需氧菌（如
枯草芽孢桿菌） 提供充足氧氣 1.液體培養(yǎng)使用搖床，保證氧氣充分溶解；2.固體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿倒置（避免冷凝水覆蓋菌落），且培養(yǎng)箱內(nèi)保持通風(fēng)（可打開通風(fēng)孔）。
厭氧菌（如
破傷風(fēng)梭菌） 嚴(yán)格隔絕氧氣 1.使用厭氧培養(yǎng)箱（充入氮?dú)饣蚨趸?，氧氣濃?< 0.1%）；2.簡(jiǎn)易操作可采用“庖肉培養(yǎng)基”或“焦性沒食子酸堿性法”。
兼性厭氧菌（如
酵母菌） 適度供氧 1.液體培養(yǎng)可低速搖床（100-150rpm），無(wú)需高強(qiáng)度通氣；2.固體培養(yǎng)與需氧菌操作一致，無(wú)需額外控氧。
四、營(yíng)養(yǎng)：固定配方，保證均一
培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和濃度差異是導(dǎo)致菌種性狀改變的重要原因，需通過“標(biāo)準(zhǔn)化配方”和“規(guī)范制備流程”確保營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)定。
1、使用固定的培養(yǎng)基配方，避免隨意調(diào)整
嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)配方稱量原料（如牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化鈉 5g，加水至 1000mL），并使用電子天平（精度 0.01g）稱量，避免憑經(jīng)驗(yàn)添加導(dǎo)致濃度偏差。
優(yōu)先使用商品化預(yù)制培養(yǎng)基（如 LB 培養(yǎng)基粉末、麥康凱瓊脂），只需按說明加水溶解即可，比自行配制更穩(wěn)定，尤其適合對(duì)營(yíng)養(yǎng)敏感的菌種。
2、確保培養(yǎng)基滅菌徹底且均一
采用高壓蒸汽滅菌法（121℃、1.05kg/cm²、20 分鐘），滅菌后輕輕搖勻液體培養(yǎng)基，避免局部成分沉淀（如瓊脂未完全溶解導(dǎo)致濃度不均）。
滅菌后的培養(yǎng)基需在 48 小時(shí)內(nèi)使用，若存放超過 24 小時(shí)，需重新檢測(cè) pH 值和無(wú)菌狀態(tài)，避免營(yíng)養(yǎng)成分降解或污染。
五、無(wú)菌環(huán)境：全程防護(hù)，避免污染
雜菌污染會(huì)與目標(biāo)菌種競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，甚至分泌有害物質(zhì)，間接破壞培養(yǎng)條件穩(wěn)定，需從“操作環(huán)境”和“工具滅菌”兩方面嚴(yán)格控制。
1、固定無(wú)菌操作環(huán)境
所有傳代操作必須在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作前開啟紫外燈消毒 30 分鐘，關(guān)閉紫外燈后通風(fēng) 15 分鐘，避免紫外線殘留損傷菌種。
操作人員需穿戴無(wú)菌手套、口罩和白大褂，手部消毒后再接觸接種工具（如接種環(huán)、移液器），避免人為帶入雜菌。
2、確保工具和容器滅菌徹底
接種環(huán)、鑷子等金屬工具采用干熱滅菌（160℃、2 小時(shí)）或火焰滅菌（操作時(shí)在酒精燈外焰灼燒至紅熱，冷卻后使用）；