大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件有哪些？具體是什么？
小楊 / 2025-11-07 09:04:17
大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件需圍繞“維持細(xì)胞活性、保留上皮細(xì)胞特性”設(shè)計(jì)，涵蓋培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、預(yù)處理及后期維護(hù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具體如下：
一、核心培養(yǎng)基體系
1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇
優(yōu)先選用DMEM/F12 培養(yǎng)基（1:1 比例），其營(yíng)養(yǎng)成分均衡，能適配上皮細(xì)胞的代謝需求；也可選用專(zhuān)用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，針對(duì)性更強(qiáng)。
避免使用單純 DMEM 或 RPMI-1640 培養(yǎng)基，這類(lèi)培養(yǎng)基缺乏上皮細(xì)胞所需的特定營(yíng)養(yǎng)因子，易導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或功能衰退。
2、添加劑與血清配置
胎牛血清（FBS）：添加 10%-15% 的優(yōu)質(zhì) FBS（需篩選無(wú)支原體、低內(nèi)毒素批次），提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)、激素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；原代培養(yǎng)初期可適當(dāng)提高至 15%，傳代后維持 10% 即可。
抗生素：加入 100U/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素，抑制細(xì)菌污染；若需長(zhǎng)期培養(yǎng)，可定期更換抗生素種類(lèi)，避免耐藥性產(chǎn)生。
上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子：必備添加劑包括表皮生長(zhǎng)因子（濃度 10-20ng/mL，促進(jìn)細(xì)胞增殖）、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（1% 濃度，改善細(xì)胞代謝）；可選添加氫化可的松（1-5μg/mL，維持上皮細(xì)胞表型）、牛血清白蛋白（0.1%-0.2%，增強(qiáng)細(xì)胞貼壁能力）。
3、培養(yǎng)基預(yù)處理
所有培養(yǎng)基使用前需在 37℃水浴中預(yù)熱 30 分鐘，避免低溫刺激細(xì)胞；同時(shí)調(diào)整 pH 值至 7.2-7.4，與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持一致。
現(xiàn)配現(xiàn)用，未使用的培養(yǎng)基 4℃冷藏保存，存放不超過(guò) 1 周，避免營(yíng)養(yǎng)成分降解。
二、培養(yǎng)環(huán)境參數(shù)
1、溫度與氣體環(huán)境
培養(yǎng)箱溫度嚴(yán)格控制在37℃，模擬大鼠體內(nèi)生理溫度，溫度波動(dòng)不超過(guò) ±0.5℃，否則會(huì)影響細(xì)胞代謝和增殖。
氣體環(huán)境為95% 空氣 + 5% CO?，其中 CO?維持培養(yǎng)基的 pH 穩(wěn)定，空氣提供細(xì)胞呼吸所需的氧氣；培養(yǎng)箱內(nèi)需保持飽和濕度（約 95%），防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導(dǎo)致滲透壓升高。
2、培養(yǎng)容器預(yù)處理
由于膽管上皮細(xì)胞貼壁依賴(lài)性強(qiáng)，培養(yǎng)瓶/皿需提前用鼠尾膠原 Ⅰ（10μg/cm²） 或纖連蛋白包被，37℃孵育 2 小時(shí)后吸棄包被液，晾干備用，可顯著提高細(xì)胞貼壁率。
選用無(wú)菌一次性培養(yǎng)容器，避免反復(fù)使用導(dǎo)致的細(xì)胞污染或機(jī)械損傷。
三、培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵維護(hù)
1、換液頻率與操作
原代培養(yǎng)后24 小時(shí)首次換液，去除未貼壁的死細(xì)胞和殘留酶液；后續(xù)每 2-3 天換液一次，換液時(shí)保留 1/3 舊培養(yǎng)基，減少環(huán)境突變對(duì)細(xì)胞的沖擊。
換液操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，動(dòng)作輕柔，避免培養(yǎng)基飛濺導(dǎo)致污染，同時(shí)防止液體沖擊貼壁細(xì)胞。
2、傳代時(shí)機(jī)與方法
當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90% 時(shí)及時(shí)傳代，避免細(xì)胞過(guò)度密集導(dǎo)致接觸抑制。
傳代時(shí)用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液消化 2-3 分鐘，顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打分散細(xì)胞，按 1:2 或 1:3 比例接種至新的包被培養(yǎng)瓶中。
3、污染防控
全程嚴(yán)格無(wú)菌操作，實(shí)驗(yàn)器械、耗材需經(jīng)高壓滅菌處理，超凈工作臺(tái)使用前用紫外燈照射 30 分鐘消毒。
定期觀察細(xì)胞狀態(tài)，若出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、有異常顆粒或菌絲，需及時(shí)排查細(xì)菌、真菌污染；通過(guò) PCR 法定期檢測(cè)支原體，發(fā)現(xiàn)污染立即丟棄細(xì)胞，避免擴(kuò)散。
四、特殊培養(yǎng)需求（按需調(diào)整）
無(wú)血清培養(yǎng)：若用于藥物篩選等實(shí)驗(yàn)，可采用無(wú)血清培養(yǎng)基，添加重組生長(zhǎng)因子替代血清，減少血清成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。
共培養(yǎng)體系：研究細(xì)胞間相互作用時(shí)，可與肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基需兼顧兩種細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，通常以 DMEM/F12 為基礎(chǔ)，調(diào)整生長(zhǎng)因子濃度。
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