大鼠肝內膽管上皮細胞的培養(yǎng)條件有哪些？具體是什么？
小楊 / 2025-11-07 09:04:17
大鼠肝內膽管上皮細胞的培養(yǎng)條件需圍繞“維持細胞活性、保留上皮細胞特性”設計，涵蓋培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境、預處理及后期維護等關鍵環(huán)節(jié)，具體如下：
一、核心培養(yǎng)基體系
1、基礎培養(yǎng)基選擇
優(yōu)先選用DMEM/F12 培養(yǎng)基（1:1 比例），其營養(yǎng)成分均衡，能適配上皮細胞的代謝需求；也可選用專用上皮細胞培養(yǎng)基，針對性更強。
避免使用單純 DMEM 或 RPMI-1640 培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基缺乏上皮細胞所需的特定營養(yǎng)因子，易導致細胞生長緩慢或功能衰退。
2、添加劑與血清配置
胎牛血清（FBS）：添加 10%-15% 的優(yōu)質 FBS（需篩選無支原體、低內毒素批次），提供細胞生長所需的蛋白質、激素等營養(yǎng)物質；原代培養(yǎng)初期可適當提高至 15%，傳代后維持 10% 即可。
抗生素：加入 100U/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素，抑制細菌污染；若需長期培養(yǎng)，可定期更換抗生素種類，避免耐藥性產生。
上皮細胞生長因子：必備添加劑包括表皮生長因子（濃度 10-20ng/mL，促進細胞增殖）、胰島素轉鐵蛋白硒（1% 濃度，改善細胞代謝）；可選添加氫化可的松（1-5μg/mL，維持上皮細胞表型）、牛血清白蛋白（0.1%-0.2%，增強細胞貼壁能力）。
3、培養(yǎng)基預處理
所有培養(yǎng)基使用前需在 37℃水浴中預熱 30 分鐘，避免低溫刺激細胞；同時調整 pH 值至 7.2-7.4，與細胞內環(huán)境保持一致。
現(xiàn)配現(xiàn)用，未使用的培養(yǎng)基 4℃冷藏保存，存放不超過 1 周，避免營養(yǎng)成分降解。
二、培養(yǎng)環(huán)境參數
1、溫度與氣體環(huán)境
培養(yǎng)箱溫度嚴格控制在37℃，模擬大鼠體內生理溫度，溫度波動不超過 ±0.5℃，否則會影響細胞代謝和增殖。
氣體環(huán)境為95% 空氣 + 5% CO?，其中 CO?維持培養(yǎng)基的 pH 穩(wěn)定，空氣提供細胞呼吸所需的氧氣；培養(yǎng)箱內需保持飽和濕度（約 95%），防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導致滲透壓升高。
2、培養(yǎng)容器預處理
由于膽管上皮細胞貼壁依賴性強，培養(yǎng)瓶/皿需提前用鼠尾膠原 Ⅰ（10μg/cm²） 或纖連蛋白包被，37℃孵育 2 小時后吸棄包被液，晾干備用，可顯著提高細胞貼壁率。
選用無菌一次性培養(yǎng)容器，避免反復使用導致的細胞污染或機械損傷。
三、培養(yǎng)過程中的關鍵維護
1、換液頻率與操作
原代培養(yǎng)后24 小時首次換液，去除未貼壁的死細胞和殘留酶液；后續(xù)每 2-3 天換液一次，換液時保留 1/3 舊培養(yǎng)基，減少環(huán)境突變對細胞的沖擊。
換液操作在超凈工作臺內進行，動作輕柔，避免培養(yǎng)基飛濺導致污染，同時防止液體沖擊貼壁細胞。
2、傳代時機與方法
當細胞融合度達到80%-90% 時及時傳代，避免細胞過度密集導致接觸抑制。
傳代時用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液消化 2-3 分鐘，顯微鏡下觀察到細胞變圓、間隙增大時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打分散細胞，按 1:2 或 1:3 比例接種至新的包被培養(yǎng)瓶中。
3、污染防控
全程嚴格無菌操作，實驗器械、耗材需經高壓滅菌處理，超凈工作臺使用前用紫外燈照射 30 分鐘消毒。
定期觀察細胞狀態(tài)，若出現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、有異常顆?；蚓z，需及時排查細菌、真菌污染；通過 PCR 法定期檢測支原體，發(fā)現(xiàn)污染立即丟棄細胞，避免擴散。
四、特殊培養(yǎng)需求（按需調整）
無血清培養(yǎng)：若用于藥物篩選等實驗，可采用無血清培養(yǎng)基，添加重組生長因子替代血清，減少血清成分對實驗結果的干擾。
共培養(yǎng)體系：研究細胞間相互作用時，可與肝細胞、肝星狀細胞構建共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)基需兼顧兩種細胞的營養(yǎng)需求，通常以 DMEM/F12 為基礎，調整生長因子濃度。
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