小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)過程中需要注意哪些事項？
小楊 / 2025-12-04 09:22:29
小鼠氣道平滑肌細(xì)胞（MASMCs）的分離培養(yǎng)是獲取高純度、高活性細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，操作細(xì)節(jié)直接影響細(xì)胞存活率和功能完整性，以下是分階段的核心注意事項：
一、實驗前準(zhǔn)備階段
1、實驗動物與耗材質(zhì)控
選擇 6-8 周齡 SPF 級小鼠（雌雄均可，體重 18-22g），避免老年鼠（氣道纖維化嚴(yán)重，細(xì)胞活性低）或幼鼠（組織量少，分離難度大）；實驗前確認(rèn)小鼠無呼吸道感染，處死前禁食 12h（減少腸道污染）。
所有耗材（培養(yǎng)皿、離心管、移液管等）需經(jīng)高壓滅菌（121℃、30min）或一次性無菌耗材；手術(shù)器械（眼科剪、鑷、止血鉗）需高溫滅菌后，在 75% 酒精中浸泡備用，使用前用無菌 PBS 沖洗去除酒精殘留。
2、試劑配制與預(yù)溫
消化液（0.2% 膠原酶 Ⅰ/Ⅳ + 0.25% 胰蛋白酶，按 1:1 體積混合）需現(xiàn)配現(xiàn)用，用無鈣鎂 PBS 配制，經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾除菌；培養(yǎng)基（DMEM/F12 + 10% 胎牛血清 + 1% 雙抗）提前 1h 放入 37℃水浴預(yù)熱，避免冷刺激損傷細(xì)胞。
全程使用無菌 PBS（含 1% 雙抗），禁止使用含 EDTA 的 PBS（EDTA 會螯合鈣離子，影響平滑肌細(xì)胞貼壁）。
二、組織分離階段（無菌操作核心）
1、小鼠處死后的組織處理
采用頸椎脫臼法處死小鼠，75% 酒精全身浸泡 3-5min（注意避免酒精進(jìn)入氣道），在超凈工作臺內(nèi)解剖，先剪開頸部皮膚暴露氣管，再沿胸骨中線剪開胸腔，完整分離氣管 + 主支氣管（避免連帶肺組織和食管，減少成纖維細(xì)胞污染）。
分離的氣道組織立即放入預(yù)冷的無菌 PBS 中反復(fù)漂洗 3 次，去除血漬和殘留組織，修剪掉氣管軟骨環(huán)外側(cè)的結(jié)締組織（成纖維細(xì)胞主要來源），僅保留軟骨環(huán)間的平滑肌層。
2、組織剪碎與消化控制
將修剪后的氣道組織剪成 1mm³ 左右的小塊（過大會導(dǎo)致消化不充分，過小易損傷細(xì)胞），轉(zhuǎn)移至含消化液的離心管中，37℃恒溫?fù)u床（100rpm）消化 40-60min，期間每 15min 輕搖一次，觀察組織塊是否變透明（消化過度會導(dǎo)致細(xì)胞破裂，不足則細(xì)胞難以脫落）。
消化終止：加入等體積含血清的培養(yǎng)基（血清中胰酶抑制劑可終止消化），用巴氏吸管輕輕吹打組織塊，使細(xì)胞脫落，避免劇烈吹打（破壞平滑肌細(xì)胞的梭形結(jié)構(gòu)）。
三、細(xì)胞純化與接種階段
1、離心與過濾
消化后的細(xì)胞懸液經(jīng) 200 目無菌尼龍網(wǎng)過濾（去除未消化的組織塊和軟骨碎片），1000rpm、室溫離心 5min（轉(zhuǎn)速過高易擠壓細(xì)胞，過低則細(xì)胞沉淀不充分），棄上清后用預(yù)溫的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
2、接種與貼壁控制
按 1×10? cells/cm² 密度接種于明膠包被的培養(yǎng)皿（0.1% 明膠 37℃包被 1h，吸棄后使用，增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞貼壁能力），避免接種密度過高（易導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增殖）或過低（細(xì)胞自分泌因子不足，存活率低）。
接種后將培養(yǎng)皿輕晃使細(xì)胞均勻分布，立即放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，前 24h 禁止移動或換液（平滑肌細(xì)胞貼壁慢，擾動會導(dǎo)致貼壁失?。?/div>
四、培養(yǎng)與傳代階段
1、換液與污染監(jiān)測
接種 24h 后首次換液，吸棄上清（去除未貼壁的死細(xì)胞和紅細(xì)胞），加入新鮮完全培養(yǎng)基；后續(xù)每 2-3 天換液一次，換液時沿培養(yǎng)皿壁緩慢加液，避免直沖細(xì)胞層。
每日觀察細(xì)胞狀態(tài)：正常 MASMCs 為梭形，貼壁生長，若出現(xiàn)圓形懸浮細(xì)胞（死細(xì)胞）、培養(yǎng)基渾濁（細(xì)菌污染）或絮狀沉淀（真菌污染），立即丟棄，避免污染擴(kuò)散。
2、傳代時機(jī)與操作
待細(xì)胞融合至 80%-90% 時傳代（融合過度易導(dǎo)致細(xì)胞接觸抑制，失去平滑肌細(xì)胞特性），優(yōu)先選擇第 1-3 代細(xì)胞（傳代超過 3 代后，α-SMA 表達(dá)下降，功能喪失）。
傳代時用 0.25% 胰蛋白酶（不含 EDTA）消化，37℃孵育 1-2min，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓后立即終止消化；傳代比例 1:2，避免 1:3 以上稀釋（細(xì)胞密度過低，增殖速度減慢）。
五、其他關(guān)鍵注意事項
無菌操作貫穿全程：超凈工作臺使用前紫外照射 30min，操作時佩戴無菌手套、口罩，避免說話或咳嗽；所有操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行，禁止徒手接觸無菌耗材內(nèi)壁。
溫度與 pH 控制：全程保持試劑和操作環(huán)境溫度（37℃），培養(yǎng)基 pH 維持在 7.2-7.4（過酸或過堿會抑制細(xì)胞活性），CO?濃度嚴(yán)格控制在 5%（濃度過高導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化）。
細(xì)胞純度驗證：培養(yǎng)后需通過免疫熒光檢測 α-SMA（平滑肌特異性標(biāo)志物），確保細(xì)胞純度＞90%；若成纖維細(xì)胞污染（形態(tài)為扁平多角形），可通過差速貼壁法純化（成纖維細(xì)胞貼壁快，接種 1h 后吸棄上清，轉(zhuǎn)移未貼壁的平滑肌細(xì)胞至新培養(yǎng)皿）。
避免反復(fù)凍融：原代分離的細(xì)胞盡量新鮮使用，如需凍存，選擇第 2 代對數(shù)生長期細(xì)胞，凍存液（培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1）緩慢降溫（4℃ 30min→-20℃ 1h→-80℃過夜→液氮保存），復(fù)蘇時快速 37℃水浴融化，減少 DMSO 損傷。
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