金黃色葡萄球菌檢測中常見的問題與成因及解決方案與操作！
小楊 / 2026-02-02 10:03:07
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是食品、臨床、環(huán)境檢測中高頻關(guān)注的致病菌，其檢測涵蓋定性篩查、定量計數(shù)、腸毒素檢測三大核心環(huán)節(jié)，檢測過程中易因樣品前處理、培養(yǎng)基、操作規(guī)范、菌株特性等因素出現(xiàn)假陽性、假陰性、計數(shù)偏差、鑒定錯誤等問題。以下按樣品前處理、培養(yǎng)分離、鑒定計數(shù)、腸毒素檢測四大關(guān)鍵階段，梳理檢測中最常見的問題、成因及解決方案，并補充質(zhì)控要點，覆蓋食品微生物檢測主流國標（GB 4789.10）及實驗室常規(guī)操作場景。
一、樣品前處理階段：目標菌回收率低、雜菌干擾嚴重
樣品前處理是檢測的基礎，若操作不當會直接導致目標菌未被有效釋放、富集，或雜菌過度增殖掩蓋 SA 菌落，是假陰性、計數(shù)偏低的首要誘因。
常見問題 1：固體/半固體樣品均質(zhì)不充分，目標菌包裹未釋放
成因：肉類、乳制品、糕點、醬料等樣品質(zhì)地黏稠/有組織性，僅簡單振蕩未均質(zhì)，SA 被樣品基質(zhì)包裹，無法進入增菌液；均質(zhì)杯/袋清洗不徹底，殘留抑菌物質(zhì)。
解決方案：
嚴格按國標采用無菌均質(zhì)器，固體樣品加稀釋液后均質(zhì) 1~2 min（轉(zhuǎn)速 8000~10000 r/min），半固體樣品可適當增加稀釋液比例（如 1:10 改為 1:20）；
均質(zhì)器具需經(jīng)無菌水沖洗 3 次以上并烘干，禁止用含抑菌成分的洗滌劑；
含顆粒的樣品（如堅果、肉制品）均質(zhì)后若有沉淀，取上清液進行增菌，避免顆粒吸附目標菌。
常見問題 2：樣品稀釋不當，濃度超出檢測范圍/抑菌
成因：高污染樣品未做梯度稀釋，菌體濃度過高導致營養(yǎng)競爭、代謝產(chǎn)物抑菌；稀釋液選擇錯誤（如用自來水代替無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液），滲透壓不適宜導致 SA 死亡。
解決方案：
未知污染程度的樣品做10?¹、10?²、10?³梯度稀釋，均進行增菌/涂布，避免漏檢；
稀釋液僅用0.85% 無菌生理鹽水或0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2~7.4），現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存不超過 72 h；
稀釋操作在無菌超凈臺內(nèi)完成，每稀釋一次更換無菌移液管，避免交叉污染。
常見問題 3：增菌液添加不當，抑菌劑/營養(yǎng)不匹配
成因：
選擇性增菌液氯化鈉濃度偏差（過高導致 SA 死亡，過低無法抑制雜菌）；
增菌液未滅菌徹底，出現(xiàn)雜菌污染；
樣品含防腐劑，未添加中和劑，導致 SA 被抑制。
解決方案：
配制 7.5% 氯化鈉肉湯時，精準稱量 NaCl，定容后驗證滲透壓，滅菌后冷卻至室溫無結(jié)晶析出；
增菌液采用121℃、15 min高壓蒸汽滅菌，滅菌后做空白對照，確認無菌生長；
對含防腐劑的樣品，在增菌液中添加對應中和劑（如含山梨酸的樣品加 0.5% 吐溫 - 80，含季銨鹽的樣品加 0.3% 卵磷脂）。
常見問題 4：增菌培養(yǎng)條件失控，目標菌未充分增殖
成因：培養(yǎng)溫度偏離 36±1℃、培養(yǎng)時間不足 18~24 h（SA 增殖慢），或搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速過高（導致菌體破裂）。
解決方案：
采用隔水式培養(yǎng)箱（溫度均勻性優(yōu)于電熱恒溫培養(yǎng)箱），定期校準溫度（誤差≤±0.5℃）；
靜置培養(yǎng) 18~24 h，若樣品雜菌少，可延長至 28 h（避免過度培養(yǎng)導致雜菌增殖）；
液體樣品可輕微振蕩（轉(zhuǎn)速 50~100 r/min），促進營養(yǎng)交換，避免菌體沉底。
二、培養(yǎng)分離階段：菌落識別錯誤、假陽性/假陰性高發(fā)
該階段核心是通過選擇性培養(yǎng)基分離 SA，易因培養(yǎng)基質(zhì)量、菌落形態(tài)誤判、挑取不當導致檢測偏差，是實驗室最易出錯的環(huán)節(jié)。
常見問題 1：BP 瓊脂質(zhì)量不合格，目標菌不生長/菌落特征不典型
成因：
BP 瓊脂中卵黃乳液添加量不足/失活（卵黃是 SA 脂酶的底物，無卵黃則無典型的“暈圈”）；
培養(yǎng)基 pH 偏離 6.8~7.2（SA 適宜中性偏酸環(huán)境，pH 過高/過低抑制生長）；
培養(yǎng)基滅菌后冷卻溫度過高（＞50℃），加入卵黃乳液時導致卵黃蛋白變性失活。
解決方案：
選擇正規(guī)廠家的 BP 瓊脂干粉，現(xiàn)配現(xiàn)用，卵黃乳液在培養(yǎng)基冷卻至45~50℃ 時無菌操作加入，輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡）；
配制后用 pH 計校準 pH，偏差超過 0.2 時用 1 mol/L HCl/NaOH 調(diào)整；
倒板后在超凈臺內(nèi)晾干（表面無冷凝水），4℃保存不超過 72 h，使用前恢復至室溫。
常見問題 2：菌落形態(tài)誤判，假陽性/假陰性
SA 在 BP 瓊脂上的典型菌落：直徑 2~3 mm，圓形、凸起、濕潤、有光澤，呈灰黑色至黑色，周圍有渾濁的沉淀環(huán)（脂酶分解卵黃） 和透明的水解圈（蛋白酶分解酪蛋白）；但實際檢測中因菌株變異、雜菌干擾，菌落特征易不典型，導致誤判。
假陽性：將雜菌誤判為 SA
解決方案：僅靠菌落形態(tài)不能判定 SA，必須結(jié)合生化試驗/分子生物學鑒定，挑取菌落時優(yōu)先選擇雙圈特征明顯的黑色菌落，若菌落特征不典型，多挑取 3~5 個菌落進行后續(xù)鑒定，避免漏檢/誤判。
假陰性：漏檢非典型 SA 菌落
成因：
部分 SA 菌株脂酶/蛋白酶活性弱，僅形成淺黑色菌落，無明顯雙圈；
解決方案：
增菌液涂布前，可做革蘭氏染色初篩，若發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性球菌、葡萄串狀排列，即使 BP 瓊脂上菌落不典型，也需挑取鑒定；
若雜菌過多，將增菌液做 10?¹ 稀釋后再涂布 BP 瓊脂，降低雜菌濃度；
對疑似菌落，直接進行血漿凝固酶試驗（SA 的關(guān)鍵特征），避免因形態(tài)不典型漏檢。
常見問題 3：涂布/劃線操作不當，菌落分布不均/計數(shù)誤差
成因：涂布棒未充分冷卻（燙死菌體）、涂布時壓力過大（刮破瓊脂表面）、劃線時接種環(huán)滅菌不徹底（交叉污染），導致菌落稀疏/密集，無法準確計數(shù)。
解決方案：
涂布棒經(jīng) 75% 酒精灼燒后，在空白瓊脂上冷卻 30 s 以上，再進行涂布，涂布時輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使菌液均勻分布；
定量計數(shù)時，選擇菌落數(shù)在 30~300 CFU的平板進行計數(shù)，若所有平板菌落數(shù)均超出范圍，重新稀釋涂布；
劃線分離時，每劃一區(qū)灼燒一次接種環(huán)，冷卻后再劃下一區(qū)，保證單菌落形成。
三、鑒定計數(shù)階段：生化試驗失敗、計數(shù)偏差、鑒定錯誤
該階段是確認 SA 的核心，涵蓋血漿凝固酶試驗（金標準）、生化鑒定、定量計數(shù)，易因試劑失效、操作不規(guī)范、菌株耐藥/變異導致結(jié)果錯誤。
常見問題 1：血漿凝固酶試驗假陰性/假陽性，最核心的鑒定錯誤
血漿凝固酶是 SA 的特征性酶（95% 以上的致病性 SA 產(chǎn)酶），分為試管法（檢測游離凝固酶，國標金標準） 和玻片法（檢測結(jié)合凝固酶，快速初篩），兩種方法均易出錯。
試管法假陰性
成因：
兔血漿失效（未冷藏保存、過期，或血漿中含抗凝劑過多）；
菌液濃度過低（菌懸液渾濁度低于 0.5 麥氏濃度），酶量不足；
培養(yǎng)溫度偏離 36±1℃，或培養(yǎng)時間不足 4 h（凝固酶反應慢）；
菌株為凝固酶陰性 SA（但致病性低，國標中試管法陰性可判定為非致病性 SA）。
解決方案：
選擇新鮮的兔血漿（含 0.1% 肝素鈉抗凝劑），4℃密封保存，開封后 24 h 內(nèi)使用，使用前做陽性（SA 標準菌株）和陰性（
表皮葡萄球菌標準菌株）對照；
制備菌懸液至0.5~1.0 麥氏濃度（與生理鹽水比濁，肉眼可見渾濁），加入等體積兔血漿，36±1℃水浴培養(yǎng)，分別在 4 h、24 h 觀察結(jié)果（部分菌株 4 h 內(nèi)無凝固，24 h 內(nèi)出現(xiàn)凝固）；
若水浴后出現(xiàn)管內(nèi)血液凝固，倒置試管凝塊不脫落，判定為陽性，否則為陰性。
玻片法假陽性
成因：菌懸液中含有鈣離子、鎂離子（如稀釋液為生理鹽水，離子濃度高），導致血漿自發(fā)凝固；或菌株表面有黏附因子，使菌體凝集，誤判為凝固酶陽性。
解決方案：
玻片法用無菌蒸餾水制備菌懸液（而非生理鹽水），消除離子干擾；
玻片法僅作為快速初篩，陰性結(jié)果必須用試管法驗證，國標中以試管法結(jié)果為準。
常見問題 2：生化鑒定試驗結(jié)果不符，無法確認 SA
SA 的關(guān)鍵生化特征：革蘭氏陽性球菌（葡萄串狀排列）、觸酶陽性、氧化酶陰性、發(fā)酵葡萄糖/甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、液化明膠，易因試劑失效、培養(yǎng)時間不足導致生化結(jié)果異常。
成因：觸酶試劑（3% 過氧化氫）過期、發(fā)酵管培養(yǎng)基滅菌不徹底、培養(yǎng)時間不足 24 h。
解決方案：
觸酶試驗：新鮮配制 3% 過氧化氫，滴加至菌落上，立即產(chǎn)生大量氣泡為陽性，無氣泡為陰性（葡萄球菌屬觸酶均陽性，鏈球菌屬陰性，可快速區(qū)分）；
發(fā)酵試驗：采用酚紅指示液，培養(yǎng) 24~48 h，培養(yǎng)基變黃為產(chǎn)酸，不變色為陰性，SA 發(fā)酵甘露醇必為陽性（雜菌如表皮葡萄球菌多為陰性，關(guān)鍵區(qū)分點）；
常見問題 3：定量計數(shù)結(jié)果偏差大，重復性差
成因：
平板菌落計數(shù)時，未遵循計平均菌落數(shù)、扣除空白、梯度換算原則；
挑取菌落時漏數(shù)/多數(shù)，或?qū)θ诤暇湮醋龊侠砉浪悖ㄈ诤暇浒?1 個計數(shù)）；
樣品不均勻（如固體食品中 SA 局部聚集），稀釋時未充分混勻。
解決方案：
同一稀釋度做2 個平行平板，取菌落數(shù)的平均值（若兩個平板菌落數(shù)差值超過 1 倍，重新涂布）；
計數(shù)時，肉眼觀察結(jié)合放大鏡，對黑色菌落 + 雙圈特征的 SA 菌落單獨計數(shù)，雜菌菌落忽略；
稀釋樣品時，用無菌移液管反復吹吸 10 次以上，保證菌體均勻分布；
結(jié)果換算：菌落數(shù)（CFU/g/mL）= 平板平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù)/取樣量，國標中定量檢測限為 10 CFU/g/mL。
常見問題 4：分子生物學鑒定（PCR）假陽性/假陰性
實驗室采用 PCR 檢測nuc 基因（耐熱核酸酶基因，SA 特異性基因）進行快速鑒定時，易出現(xiàn)結(jié)果偏差。
假陰性成因：DNA 提取不充分（菌體未破壁，葡萄球菌細胞壁厚）、PCR 引物失效、反應體系配置錯誤；
假陽性成因：PCR 產(chǎn)物交叉污染、模板 DNA 濃度過高、非特異性擴增；
解決方案：
DNA 提取時，采用溶菌酶 + 蛋白酶 K聯(lián)合破壁（溶菌酶終濃度 20 mg/mL，37℃水浴 30 min），保證菌體充分裂解；
PCR 反應體系現(xiàn)配現(xiàn)用，引物 - 20℃避光保存，設置空白對照（無模板）、陽性對照（SA 標準菌株 DNA）、陰性對照（雜菌 DNA）；
PCR 產(chǎn)物在超凈臺內(nèi)電泳，避免交叉污染，僅出現(xiàn)特異性目的條帶（nuc 基因約 270 bp）判定為陽性。
四、腸毒素檢測階段：漏檢產(chǎn)毒菌株、檢測結(jié)果假陰性
SA 的致病性主要源于產(chǎn)腸毒素（即使菌體被殺死，腸毒素仍耐熱，100℃煮沸 30 min 不被破壞，食用后會引發(fā)食物中毒），因此僅鑒定出 SA 菌體不足以判定樣品不合格，需檢測腸毒素，國標中食品中 SA 腸毒素檢測為必檢項，該階段易因檢測方法選擇不當、樣品前處理不充分導致漏檢。
常見問題 1：僅檢測菌體未檢測腸毒素，誤判樣品合格
成因：實驗室忽略腸毒素檢測，認為“菌落數(shù)未超標即合格”，但部分 SA 菌株雖菌落數(shù)低，卻產(chǎn)大量腸毒素，存在食品安全風險。
解決方案：
嚴格按國標要求，對疑似陽性樣品（BP 瓊脂上有 SA 菌落） 同時進行菌體鑒定和腸毒素檢測；
若樣品中 SA 菌落數(shù)超標（如食品中≥10? CFU/g），直接進行腸毒素檢測，無需考慮菌落特征。
常見問題 2：腸毒素檢測假陰性，漏檢產(chǎn)毒菌株
目前腸毒素檢測主流方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA，國標金標準）和膠體金快速檢測卡，易因樣品前處理、試劑失效導致假陰性。
成因：
樣品中腸毒素被基質(zhì)吸附（如乳制品中的酪蛋白、肉制品中的蛋白質(zhì)），未被有效提??；
ELISA 試劑過期、包被抗體失活、酶標二抗未避光保存；
膠體金檢測卡操作不當（如加樣量不足、孵育時間不夠、溫度偏離 25±3℃）。
解決方案：
樣品前處理：采用生理鹽水 + 0.5% 吐溫 - 80作為提取液，均質(zhì)后 80℃水浴 10 min（使腸毒素從基質(zhì)中釋放，同時滅活菌體），4℃離心（8000 r/min，10 min），取上清液檢測；
ELISA 檢測：試劑 4℃冷藏保存，使用前恢復至室溫，設置標準曲線、陽性對照、陰性對照，嚴格按試劑盒說明書操作，吸光度值用酶標儀校準（定期檢定）；
膠體金檢測卡：開封后 1 h 內(nèi)使用，加樣量準確（一般為 100 μL），孵育 10~15 min，僅質(zhì)控線和檢測線均出現(xiàn)紅色條帶判定為陽性，僅質(zhì)控線出現(xiàn)為陰性，質(zhì)控線未出現(xiàn)為檢測無效。
常見問題 3：腸毒素型別漏檢，未覆蓋主要致病型
SA 腸毒素有A、B、C、D、E五大主要型別（其中 A 型最常見，占食物中毒的 70% 以上），部分檢測試劑盒僅檢測 1~2 個型別，易漏檢其他型別產(chǎn)毒菌株。
解決方案：選擇覆蓋 A、B、C、D、E 五型的腸毒素檢測試劑盒，若單試劑盒無法覆蓋，采用多種試劑盒聯(lián)合檢測，確保無型別漏檢。
檢測偏差的核心誘因是質(zhì)控缺失，需從人員、試劑、設備、菌株、操作、環(huán)境六大維度建立全程質(zhì)控體系，以下為實驗室可落地的核心質(zhì)控要求：
標準菌株質(zhì)控：每次檢測設置陽性對照和陰性對照（
表皮葡萄球菌 ATCC12228），驗證培養(yǎng)基、試劑、操作的有效性，標準菌株采用凍干粉保藏，傳代不超過 5 代，避免菌株變異；
試劑培養(yǎng)基質(zhì)控：所有培養(yǎng)基、試劑（兔血漿、過氧化氫、ELISA 試劑盒）均需標注配制日期、有效期、配制人，開封后按要求保存，每次使用前做空白對照，確認無菌/無失效；
設備質(zhì)控：培養(yǎng)箱、均質(zhì)器、離心機、酶標儀、pH 計等設備，定期校準（每年至少 1 次），并做好校準記錄，超凈臺每周做一次無菌檢測（沉降菌/浮游菌）；
人員質(zhì)控：檢測人員需經(jīng)專業(yè)培訓，熟練掌握 SA 菌落識別、生化試驗、腸毒素檢測操作，定期進行盲樣考核，考核合格后方可獨立操作；
環(huán)境質(zhì)控：超凈臺、無菌室每日用 75% 酒精擦拭消毒，紫外燈照射 30 min 以上，無菌室每月做一次環(huán)境雜菌檢測，避免交叉污染；
記錄質(zhì)控：所有操作（樣品前處理、培養(yǎng)、鑒定、計數(shù)、檢測結(jié)果）均需做好原始記錄，記錄需完整、可追溯，包括樣品信息、試劑信息、設備參數(shù)、實驗結(jié)果、質(zhì)控結(jié)果等。
六、常見檢測結(jié)果判定誤區(qū)及糾正
誤區(qū) 1：BP 瓊脂上有黑色菌落 = SA 陽性→糾正：需結(jié)合革蘭氏染色 + 血漿凝固酶試驗（試管法），僅三者均符合才判定為 SA 陽性；
誤區(qū) 2：血漿凝固酶試驗玻片法陰性 = SA 陰性→糾正：玻片法僅為初篩，陰性結(jié)果必須用試管法驗證，國標以試管法結(jié)果為準；
誤區(qū) 3：SA 菌落數(shù)未超標 = 樣品合格→糾正：需同時檢測腸毒素，即使菌落數(shù)未超標，若腸毒素陽性，樣品仍判定為不合格；
誤區(qū) 4：PCR 檢測 nuc 基因陽性 = 產(chǎn)毒 SA→糾正：nuc 基因僅為 SA 菌體特異性基因，與產(chǎn)毒無直接關(guān)聯(lián)，陽性僅說明存在 SA 菌體，需進一步檢測腸毒素確認致病性。
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