李斯特菌廣泛存在于環(huán)境中，并且在很多食品中有檢出，該菌在低溫的條件下仍能存活和增殖，其中單核細胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的主要致病菌之一，也是食品安全控制的重要病原體，感染后會造成不同程度的人員死亡，受到各國的高度重視。傳統(tǒng)方法檢測費時費力而靈敏性較差，因此，快速、高效、靈敏可信的檢測方法能夠更加有效判定李斯特菌污染風(fēng)險并且控制其危害。
1 李斯特菌的污染及危害
李斯特菌在環(huán)境中普遍存在，也是污染食品的主要病原菌，往往侵染肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等食品，在4℃的環(huán)境中仍能生長繁殖，是冷藏食品中主要的病原菌之一。其中，單核細胞增生李斯特氏菌是食源性疾病的重要病原菌，WHO將其列為21世紀四大食源性致病菌之一。近年來，單核細胞增生李斯特氏菌引起的食源性疾病事件時有發(fā)生(見表1)，并造成不同程度的人員死亡，受到了各國的高度重視。
2 國內(nèi)外關(guān)于食品中
李斯特菌限量的規(guī)定
李斯特菌極容易污染食品，其中對冷藏食品和即食食品危害最為嚴重，各國均制定了食品中李斯特菌的限量值和監(jiān)測計劃。美國對即食食品中單增李斯特菌的限量規(guī)定為0/25g，并要求企業(yè)實施GHP和HACCP。中國香港2014年修訂了對即食食品和指定食品中單增李斯特菌的限量值并分別做了規(guī)定。冷藏食品(冷凝食品除外)或嬰兒食品中單增李斯特菌必須“在25g食物樣本中沒有發(fā)現(xiàn)”，其他即食食品中單增李斯特菌的限量為食物樣本中小于100CFU/g。中國大陸2013年頒布的《食品中致病菌限量標準GB29921-2013》中規(guī)定，在即食肉制品中，單增李斯特菌按照二級采樣方法取樣不得檢出(n=5，c=0，m=0)。也有一些國家，如新西蘭等國家并沒有制定相關(guān)的規(guī)定，僅制定了一個對人類健康不存在風(fēng)險的可接受水平。綜上，雖然各國均對單增李斯特菌做出了限量要求，但是對李斯特菌的限量各國的要求不一。
3 國內(nèi)外主要檢驗方法
目前，食品微生物檢測體系主要包括，中國的國家標準(GB4789)和檢驗檢疫行業(yè)標準(SN)、國際化標準化組織(ISO)方法、美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)、美國農(nóng)業(yè)部(USDA)、美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(AOAC)、加拿大健康保護部(MFLP)、歐盟食品安全局(EFSA)等檢測體系。
食品中單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢測方法主要包括增菌、分離和鑒定3個環(huán)節(jié)。目前，分離環(huán)節(jié)常會采用顯色培養(yǎng)基，使其菌落顏色不同于其它干擾菌，實現(xiàn)快速分離。鑒定常采用生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)。目前，生化反應(yīng)的鑒定技術(shù)多采用數(shù)值分類鑒定和自動化檢測技術(shù)。該技術(shù)主要包括：(1)API Listeria生化鑒定試紙條;(2)全自動微生物分析系統(tǒng)，如VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)及BIOLOG系統(tǒng)等。雖然該方法結(jié)果互認程度高，但操作強度大、檢驗周期長，需6～7d，無法實現(xiàn)快速檢測。表3介紹了ISO、USDA、FDA、中國國標和行標等檢測方法。
4 李斯特菌快速篩查技術(shù)
傳統(tǒng)方法檢測費時費力操作要求高，因此，李斯特菌快速檢測技術(shù)和產(chǎn)品的開發(fā)是必要的。美國、歐盟等發(fā)達國家對微生物快速檢測方法的研究和產(chǎn)品認證體系相對成熟，各種不同的快檢系統(tǒng)和自動化儀器被推出，并得到廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，李斯特菌快速檢測方法為增菌以后，生化鑒定之前，對樣本進行快速篩選，以縮小檢測范圍，減少檢測任務(wù)，提高檢測效率?？焖贆z測方法主要包括酶底物顯色技術(shù)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測三大類。
4.1 即用培養(yǎng)技術(shù)
即用培養(yǎng)基技術(shù)則省掉了前期準備工作，可以直接檢測樣品，從而節(jié)約了大量人力成本。目前，商業(yè)化的固定培養(yǎng)基技術(shù)主要有兩種：紙片法和即用平皿法。紙片法是指將顯色培養(yǎng)基固定于紙片上，上方再蓋一層帶有方格的透明薄膜，以方便計數(shù)。即用平皿法是指用已倒有培養(yǎng)基的平皿，接種操作與傳統(tǒng)涂板、劃線法一樣。其優(yōu)點和紙片法一樣，即省掉了前期準備工作，可以直接接種培養(yǎng)。
4.2 免疫學(xué)檢測法
該技術(shù)以抗原抗體免疫為基礎(chǔ)，制備特異性克隆抗體檢測細菌。目前國內(nèi)外李斯特菌快速檢測的此類技術(shù)主要包括：酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)、金標免疫層析技術(shù)、流式細胞技術(shù)等。ELFA靈敏度比ELISA高，并省去了ELISA中的顏色反應(yīng)，縮短反應(yīng)時間;但缺點是成本較高，目前主要應(yīng)用在自動酶聯(lián)熒光免疫檢測系統(tǒng)(VIDAS)上。金標免疫層析技術(shù)是將高度特異性抗單增李斯特菌抗原的抗體束縛在色原載體上，且可與固相支撐基質(zhì)相分離。當(dāng)檢測樣品中存在李斯特菌時，測試單元的試劑將會被展開，產(chǎn)生肉眼可見的確定性反應(yīng)。流式細胞術(shù)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)。
4.3 分子學(xué)檢測方法
分子生物學(xué)檢測方法主要包括核酸探針雜交技術(shù)、PCR檢測技術(shù)等。DNA探針法是將兩條堿基互補的DNA鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交，通過檢測樣品與標記性DNA探針之間形成的雜交分子來檢測樣品中的單增李斯特菌，測定放射性或熒光強度即可得出樣品中單增李斯特菌的個數(shù)。PCR是近年來廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)檢測方法，在單增李斯特菌的檢測中以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列(常用的靶序列包括hly、actA、prfA等)設(shè)計引物進行擴增。該方法特異性好，但靈敏度低，對樣品進行前處理后再進行擴增，可以提高檢出率和檢測靈敏度。PCR技術(shù)還可對單增李斯特菌進行定量檢測。國內(nèi)外目前主要應(yīng)用的PCR技術(shù)包括：實時熒光PCR(Real-time PCR)、多重PCR、恒溫擴增、RT-PCR方法、IMS-PCR檢測技術(shù)等。
5 小結(jié)
微生物檢測包括前處理、增菌、富集、檢測等環(huán)節(jié)。為實現(xiàn)快速、實時、準確的監(jiān)測食品微生物，每個環(huán)節(jié)都應(yīng)有相應(yīng)的篩查技術(shù)及產(chǎn)品。微生物快速檢測今后的發(fā)展趨勢主要是免疫學(xué)方法和核酸方法，分子檢測技術(shù)具有高靈敏、高特異、快速等特點，在近幾十年得到快速發(fā)展與應(yīng)用，但相關(guān)技術(shù)還應(yīng)向標準化、產(chǎn)品化方向發(fā)展，且開發(fā)更適合實時監(jiān)測微生物的現(xiàn)場快速篩查技術(shù)與設(shè)備。免疫技術(shù)以高特異、快速特點而得到廣泛應(yīng)用。我國在微生物快速檢測技術(shù)的應(yīng)用及技術(shù)研發(fā)方面相對歐洲國家比較落后，快速檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用需要政府相關(guān)機構(gòu)、科研單位、企業(yè)共同的努力建立一套快速、準確、簡單的檢測體系，此外，還需要降低檢測成本，提供檢測靈敏度和實用性，這些是今后微生物快速檢測的發(fā)展趨勢。
中國微生物查詢網(wǎng)（www.family998.com）