軍團(tuán)菌簡介
軍團(tuán)菌（Legionella）無莢膜，不產(chǎn)酸，革蘭氏染色陰性，借一兩根或以上直的或彎曲的極鞭毛和側(cè)鞭毛可以運(yùn)動(dòng)，偶爾可見無動(dòng)力菌株。需氧，生長時(shí)需L-半胱氨酸和鐵鹽。氧化酶陰性或弱陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，尿素酶陰性，液化明膠。細(xì)胞壁中有支鏈脂肪酸?？蓮挠袡C(jī)化合物中攝取營養(yǎng)，可利用氨基酸作為能量來源。不發(fā)酵碳水化合物，亦不能使之氧化?？蓮牡乇硭?、泥土和熱水及污染的湖水和河水中分離到本菌，但從土壤和動(dòng)物中分離尚不了解，對人有致病性，DNA的G+Cmol%含量為39~43%（TmBd）。
軍團(tuán)菌屬有41個(gè)種，61個(gè)血清型。侵肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila, LP）有15個(gè)血清型，是引起軍團(tuán)菌病的主要菌型（占80%以上）。軍團(tuán)菌病是一種急性呼吸道傳染病，臨床類型目前至少有肺炎型與龐蒂阿克熱型。本病主要為呼吸道飛沫(氣溶膠)傳播。目前尚無證據(jù)表明感染者、病人或感染動(dòng)物作為本病的傳染源，通常把傳染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷卻塔、冷熱管道系統(tǒng)水等)作為傳染源。
軍團(tuán)菌的檢測方法——ISO11731:1998
1． 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)描述了一種用于軍團(tuán)菌分離和估計(jì)環(huán)境樣品中軍團(tuán)菌數(shù)量的培養(yǎng)方法。
該方法適用于所有環(huán)境樣本，包括飲用水、工業(yè)用水和天然水以及沉淀物、沉積物和粘土/軟泥等相關(guān)樣本。
2． 培養(yǎng)基和試劑
2.1 BCYE瓊脂基礎(chǔ)（也可用硝酸鐵瓊脂代替）
2.2.BCYE-Cys（不含L-半胱氨酸）
2.3.GVPC培養(yǎng)基
2.4酸處理緩沖液
海博軍團(tuán)菌檢測培養(yǎng)
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產(chǎn)品 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格( g ) |
價(jià)格 （元） |
產(chǎn)品說明及用途 |
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v-054321 |
BCYE瓊脂基礎(chǔ) |
100 |
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用于軍團(tuán)菌分離培養(yǎng) |
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v-055212 |
L-半胱氨酸鹽酸鹽 |
0.04g/支*5 |
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添加于BCYE瓊脂基礎(chǔ) |
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8493b |
可溶性焦磷酸鹽 |
0.025g/支*5 |
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添加于BCYE瓊脂基礎(chǔ) |
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8485 |
硝酸鹽瓊脂 |
250 |
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用于軍團(tuán)菌分離培養(yǎng) |
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v-055211 |
BCYE-Cys培養(yǎng)基 |
100 |
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不含L-半胱氨酸 |
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v-055214 |
GVPC瓊脂基礎(chǔ) |
100 |
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用于軍團(tuán)菌選擇性分離培養(yǎng) |
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8496-1 |
GVPC添加物 |
5支/盒×1ML |
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將5支試劑無菌添加于100ml8489中 |
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v-056256 |
馬尿酸鈉 |
20支 |
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水合茚三酮 |
5g |
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SN009-1 |
尿素酶 |
20支 |
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SN039-1 |
明膠液化 |
20支 |
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SN047-1 |
硝酸鹽肉湯 |
20支 |
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HB8282 |
硝酸鹽試劑盒 |
5ml*4 |
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3． 取樣
3.1取樣容器
水樣可采用玻璃、聚乙烯或類似容器。以前用過的容器應(yīng)該清洗干凈、扣干水分，121℃高壓滅菌15min。如果容器不能經(jīng)受高壓滅菌，應(yīng)在〉70℃的流動(dòng)熱水或流動(dòng)蒸汽中處理至少5min。
3.2含生物防腐劑的樣品
如果水樣中含有或被認(rèn)為含有氧化型生物防腐劑，應(yīng)在取樣時(shí)或取樣前加入非活性試劑加以中和。
原則上講，實(shí)驗(yàn)室接到水樣后應(yīng)盡快進(jìn)行微生物學(xué)分析，最好是取樣當(dāng)天，尤其對于已知含生物防腐劑的樣品。因此，建議從樣品采集到制備好濃縮樣的間隔最好為2d，不應(yīng)超過5d，最長不超過14d。
3.3樣品運(yùn)輸
樣品應(yīng)在6-18℃條件下被運(yùn)輸，應(yīng)避免熱和光照，最好在1d內(nèi)，不超過2d將樣品送到指定實(shí)驗(yàn)室。
4． 制樣
4.1 總則
如果液體樣品軍團(tuán)菌的數(shù)量估計(jì)超過105/l，可以采用直接平板法。為了確保低于這個(gè)數(shù)量樣品中軍團(tuán)菌的檢測，需采用濃縮技術(shù)。為了濃縮水樣，可采用膜過濾法（4.2）或離心法（4.3）。
4.2膜過濾法
如果樣品是渾濁的、乳濁的或有顏色的，應(yīng)采用離心法。
采用膜過濾裝置進(jìn)行膜過濾，采用直徑47-147mm，孔徑0.22μm和0.45μm的膜。過濾后的膜應(yīng)放置在帶蓋的無菌容器中，可用無菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的無菌稀釋液或無菌去離子水，不斷搖動(dòng)至少2min。也可將容器放入超聲波中2-10min。
4.3離心法
取200ml樣品于300-500ml容積的離心瓶中，6000g離心10min或3000g離心30min，保持溫度在15-25℃，棄去上清液，將沉淀物懸浮在2-20ml無菌稀釋液或無菌去離子水中。
5． 培養(yǎng)
5.1將制備好的樣品（濃縮的或未濃縮的）分成3份，1份不做任何處理；1份進(jìn)行熱處理；1份進(jìn)行酸處理。
5.2熱處理
加1±0.5ml樣品于一無菌容器中，50±1℃水浴處理30±2min。
5.3酸處理
加1-10ml樣品于一擰蓋的容器中，6000g離心10min或3000g離心30min，用無菌槍頭吸去一半體積的上清液，通過渦旋重新懸浮剩余物，用酸處理緩沖液補(bǔ)足原始體積?；旌响o置5±0.5min。
5.4選擇性培養(yǎng)基的接種
分別接種未處理、熱處理和酸處理的樣品0.1-0.5ml于GVPC培養(yǎng)基上，熱處理和酸處理的樣品應(yīng)在處理完立即接種，記錄接種體積。
5.5培養(yǎng)
翻轉(zhuǎn)平板，36±1℃培養(yǎng)10d。
5.6檢查平板
在10d的培養(yǎng)期間，用顯微鏡在2-4d內(nèi)至少觀察3次，軍團(tuán)菌生長較慢，很可能被其他菌掩蓋，記錄每一種菌落形態(tài)的數(shù)量。
注：軍團(tuán)菌的菌落通常是白-灰-藍(lán)-紫，但也可能出現(xiàn)棕色、粉色、灰綠色或深紅色。軍團(tuán)菌表面光滑，邊緣整齊，出現(xiàn)典型的毛玻璃現(xiàn)象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色熒光；L.rubrilucens 和L.erythra呈現(xiàn)紅色；L.pneumophila菌落呈現(xiàn)暗綠色通常伴隨有黃色。熒光的顏色有助于區(qū)分樣品中軍團(tuán)菌的不同種。為了避免軍團(tuán)菌的死亡，不能將平板長時(shí)間暴露在紫外燈下。
6．可疑軍團(tuán)菌的確證
6.1BCYE和其他培養(yǎng)基的二次培養(yǎng)
從每個(gè)GVPC平板上至少選擇3個(gè)可疑軍團(tuán)菌菌落接種到BCYE和BCYE-Cys兩塊平板上進(jìn)行二次培養(yǎng)，36±1℃培養(yǎng)至少2d。在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的被認(rèn)為是軍團(tuán)菌。通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)（6.2）確證在BCYE上生長而在BCYE-Cys上不生長的菌落。
注：血瓊脂和營養(yǎng)瓊脂可以代替BCYE-Cys培養(yǎng)基。
6.2直接免疫熒光抗體法（DFA）：優(yōu)點(diǎn)是簡便、快速，缺點(diǎn)是敏感性低，且只能用于LP的檢測。
6.3 PCR及其相關(guān)技術(shù)：優(yōu)點(diǎn)：有著更高的靈敏度和特異性，缺點(diǎn)：非特異性擴(kuò)增及交叉污染