銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌，是引起急性或慢性感染的最常見的條件致病菌之一，由其引起的院內(nèi)感染往往治療難度極大，幾乎具有目前已知的細菌主要耐藥機制，已成為引起院內(nèi)獲得性肺炎多重耐藥革蘭陰性菌的代表。PA 感染是治療的難題，歸其原因，在于其廣泛而多重的耐藥性。因此，了解銅綠假單胞菌的耐藥相關(guān)基因的情況，有助于臨床研發(fā)更有效的治療銅綠假單胞菌感染性疾病的抗菌藥物。PA 的耐藥機制概括起來主要有以下幾個方面：各種外排泵系統(tǒng)的過度表達、外膜通透性的降低、藥物作用靶位的改變、氨基糖苷類修飾酶的產(chǎn)生、細菌生物被膜形成以及產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶等。由于這些機制可以共存，故PA 往往具有多重耐藥性。本文主要對上述幾種耐藥機制的相關(guān)耐藥基因的進展作一綜述。
一、與主動外排泵系統(tǒng)相關(guān)的耐藥基因研究
銅綠假單胞菌藥物是一種革蘭陰性桿菌，其主動外排泵系統(tǒng)最早于1993 年被報道，具有編碼超過50 個潛在多藥轉(zhuǎn)運體的能力。目前在PA 中已報道有MexGHIOprD、MexVW-OprM、MexPQ-OprE 和MexMN-OprM等9 種外排泵系統(tǒng)。其中，外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexJK-OprM 和MexXYOprM對PA 耐藥性的作用已被明確證實。PA 的主動外排系統(tǒng)主要由3 部分組成：一是具有藥物識別作用的內(nèi)膜蛋白，如MexB、MexD、MexF 和MexY 等。二是可以將藥物泵出菌體的外膜通道蛋白，如OprM、OprJ和OprN 等。三是起到連接作用的輔助蛋白，如MexA、MexC 和MexE 等。正是由于這些主動外排系統(tǒng)的存在，PA 對多種抗菌藥物能夠形成固有性耐藥或獲得性耐藥。
MexAB-OprM 在PA 外排泵系統(tǒng)研究中最詳實，其決定了PA 的固有耐藥性。MexAB-OprM 包含3 個結(jié)構(gòu)編碼基因，在野生銅綠假單胞菌株中可表達。MexABOprM外排泵系統(tǒng)可轉(zhuǎn)運包括β- 內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗菌藥物以及β- 內(nèi)酰胺酶抑制劑等種類繁多的底物，使得PA 具有廣泛的耐藥性。MexAB-OprM 外排泵的關(guān)鍵特性是可將大量的β- 內(nèi)酰胺類抗菌藥物泵出菌體外。MexA 和（或）MexB 在該外排系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的藥物識別作用。β- 內(nèi)酰胺類藥物先經(jīng)外膜進入膜間隙，然后被MexB 俘獲，最后借助MexA 的橋接作用，經(jīng)OprM 排出菌體外。在生理狀態(tài)下，MexAB-OprM阻遏蛋白是mexR 基因編碼的產(chǎn)物，當mexR 基因發(fā)生突變時，MexAB-OprM 可因脫離抑制而出現(xiàn)表達增強，形成獲得性耐藥。
MexCD-OprJ 在實驗室條件生長的野生PA 菌株中，該外排泵系統(tǒng)通常不發(fā)生表達，但在nfxB 突變株中卻高度表達。單一使用喹諾酮類藥物治療后有可能出現(xiàn)突變株的產(chǎn)生。MexCD-OprJ 外排泵可導(dǎo)致PA 對四代頭孢、氯霉素類、四環(huán)素類和其他抗菌復(fù)合物的耐藥。
MexEF-OprN 在nfxC 突變的PA 株中，此系統(tǒng)可發(fā)生高度表達。mexT 抑制OprD 基因表達的同時增加了MexEF-OprN 外排泵系統(tǒng)的表達，使細胞內(nèi)通過OprD 通道進行滲透的抗菌藥物的濃度出現(xiàn)普遍降低，從而導(dǎo)致PA 對碳青霉烯（主要是亞胺培南）類抗菌藥物出現(xiàn)交叉耐藥。
MexXY-OprM 該外排泵系統(tǒng)受mexZ 基因調(diào)控，mexZ 基因的突變可導(dǎo)致細菌對氨基糖苷類、氟喹諾酮類等耐藥性的形成[11]。MexJK-OprM 該外排泵系統(tǒng)由mexL 基因調(diào)控，可選擇性暴露在三氯生下表達，可將四環(huán)素和紅霉素泵出細菌體外。
MexVW-OprM 該外排泵系統(tǒng)的的編碼基因為mexVW，該基因位于重組性質(zhì)粒pTAJ2 上，該外排系統(tǒng)可介導(dǎo)PA 對氟喹諾酮類、四環(huán)素等產(chǎn)生耐藥性。
多研究發(fā)現(xiàn)，各種類型外排泵的表達可呈現(xiàn)相關(guān)性，如外排泵系統(tǒng)MexAB-OprM 與MexCD-OprJ、MexEFOprN的表達呈現(xiàn)負性相關(guān)，臨床分離所得的耐藥PA 亦常常檢出兩種或三種外排泵同時高表達的狀況。國內(nèi)有學(xué)者對臨床標本分離所得的80 株多重耐藥銅綠假單胞菌株進行耐藥表型檢測發(fā)現(xiàn)，其中有80% 的菌株檢出了不同類型外排泵基因。
二、與外膜通透性障礙相關(guān)的耐藥基因研究
外膜上的孔蛋白通道或脂質(zhì)通道是抗菌藥物通過的橋梁。如果這些通道發(fā)生改變或缺失，抗菌藥物的殺菌作用將受到限制，敏感性將大大降低，從而使耐藥性增強。大量的研究表明，大部分革蘭陰性桿菌具有高通透性的孔蛋白通道和相對較少的特異性蛋白通道，而銅綠假單胞菌外膜則存在著主要的特異性通道[15]，如OprC、OprD2、OprE1 和OprF 等， 其中OprC、OprD2和OprE1 為小分子微孔蛋白，分子質(zhì)量分別為70 kD、46 kD、43 kD，這些微孔蛋白形成的孔道滲透速度僅為其他多數(shù)革蘭陰性桿菌的1%。而Bent 等[16] 研究結(jié)果表明，PA 中富含大孔通道蛋白OprF。但OprF 并不具備通透功能[17]，這使得PA 外膜低通透性與大通道之間的矛盾得到解釋。除此之外，特異性外膜通道的突變可以導(dǎo)致細菌耐藥性的形成。如當外膜蛋白OprD2 的缺失或表達減少時，可引起PA 對亞胺培南耐藥。有實驗證明，對耐亞胺培南的PA 轉(zhuǎn)入帶有OprD2 編碼基因的質(zhì)粒后，PA 對亞胺培南的耐藥性消失。因此，OprD2 被認為是亞胺培南進入PA 的通道。
三、改變藥物作用靶位的耐藥基因研究
當抗菌藥物的作用靶位（如青霉素結(jié)合蛋白和DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ）發(fā)生改變時，可引起PA 對其耐藥。青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）存在于PA 的內(nèi)膜上，當其與β- 內(nèi)酰胺類藥物結(jié)合后會失去酶的活性，從而引起PA 死亡。因此，當PBPs 基因發(fā)生變異時，其與β- 內(nèi)酰胺類藥物的結(jié)合能力就會出現(xiàn)降低或者難以與此類藥物發(fā)生結(jié)合，從而使PA 形成對該類抗菌藥物的耐藥性。當然，PA 亦可改變DNA 拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的結(jié)構(gòu)而使其對喹諾酮類藥物的敏感性消失。如當DNA旋轉(zhuǎn)酶（DNA gyrase）的gyrA 基因或Ⅳ -topoisomerase的parC 基因此類細菌的靶位基因產(chǎn)生突變時，可引起銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥性的形成。
四、與氨基糖苷類修飾酶產(chǎn)生相關(guān)的耐藥基因的研究
PA 可通過產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶（aminoglycosidemodifyingenzymes，AME）而形成耐藥性。這一途徑是PA 對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因。除此之外，PA 亦可因其作用靶位基因的突變（如16S rRNA 基因的突變）而導(dǎo)致其對氨基糖苷類抗菌藥物敏感性的消失。AME 由乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetyl transferase，AAC）、磷酸轉(zhuǎn)移酶（phosphate transferase，APH）和核苷轉(zhuǎn)移酶（nucleotidyltransferase，ANT）3 大類所組成。這些修飾酶相關(guān)編碼基因有aac(3)- Ⅰ、aph(3 ＇ )- Ⅵ、ant(3 〃)- Ⅰ等30 余種。Aghazadeh 等對67 株P(guān)A 菌株進行氨基糖苷類修飾酶基因檢測發(fā)現(xiàn)aph(3 ＇ )- Ⅱ b 是其中最主要的基因型。
五、與生物被膜形成相關(guān)的耐藥基因研究
生物被膜是造成抗菌藥物耐藥的重要原因，指的是一個多菌細胞群體結(jié)構(gòu)，可由細菌自身，及其產(chǎn)生的外部多糖基質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等共同包裹所組成，其通過阻止和抑制白細胞、抗菌藥物等進入生物膜中殺滅細菌而產(chǎn)生耐藥性。有調(diào)查表明，超過65% 的細菌感染與生物被膜形成相關(guān)[24]。當生物被膜成熟后，菌體密度增加引起了群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing，QS）的激活，從而激活特定的基因發(fā)生表達。PA 具有QS 系統(tǒng)典型的的特征，其代表為Las 群體感應(yīng)系統(tǒng)。Las 系統(tǒng)由LasR 和LasI 基因組成，LasR 基因編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白LasR，LasI 基因編碼轉(zhuǎn)錄自誘導(dǎo)分子3- 氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)脂（3-O-C12-HSL）。當3-O-C12-HSL 增加到一定濃度時便分別與Las 蛋白特定性結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)LasA、LasB、aprA 和Rpos 等一系列下游致病基因的表達，調(diào)控毒力因子的產(chǎn)生。QS 系統(tǒng)已被證實與抗菌藥物的耐藥性相關(guān)。其機制目前尚不十分清楚，目前存在3 種假說：一是滲透限制，主要從生物膜的結(jié)構(gòu)上分析；二是營養(yǎng)限制，由于細菌密度增加形成了營養(yǎng)成分梯度，被膜內(nèi)的細菌生長速度出現(xiàn)減慢，從而引起各種耐藥基因表達的上調(diào)；三是表型推斷，指的是膜內(nèi)某些細菌采用與浮游細菌不同的有保護作用的生物膜表型。其中表型推斷是目前解釋生物膜耐藥的主要研究方向，已被證實。
六、與產(chǎn)生滅活酶相關(guān)的耐藥基因研究
產(chǎn)生β- 內(nèi)酰胺酶是PA 耐藥的重要機制之一。PA產(chǎn)生的滅活酶包括超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶、頭孢菌素酶及金屬β- 內(nèi)酰胺酶。滅活酶起作用的途徑是破壞β- 內(nèi)酰胺環(huán)。這個過程通過質(zhì)粒介導(dǎo)或染色體突變產(chǎn)生。
1. 超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶（ESBLs）：包括A 類ESBLs 及苯唑西林酶（OXA）。A 類ESBLs 主要包括TEM、SHV、PER、VEB、GES/IBC 和BEL 共6 型，都具有類似的水解作用，但基因同源性不高。OXA 屬于Ambler D 類，Bush 2d 組，耐藥譜通常較窄，但近年來不斷發(fā)現(xiàn)超廣譜OXA 型酶，主要包括OXA-2 或OXA-10 的突變衍生酶。
2. 頭孢菌素酶（又稱為AmpC 酶）：AmpC 酶由AmpC 基因編碼產(chǎn)生，有很強的誘導(dǎo)性。AmpC 酶可分為誘導(dǎo)型、結(jié)構(gòu)型和質(zhì)粒型。其中質(zhì)粒型 AmpC 酶使人類對抗PA 的斗爭非常困難，因為其耐藥質(zhì)?？梢栽谙嗤N間或不同菌種間相互傳播。
3. 金屬β- 內(nèi)酰胺酶（MBLs），又稱金屬酶或碳青霉烯酶。MBLs 的活性部位為金屬離子，其活性不能被舒巴坦等常見的β- 內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制，隨著這些金屬酶的出現(xiàn)，耐亞胺培南PA 的比例在增加，其中以VIM-2 型占主導(dǎo)地位。
目前PA 中發(fā)現(xiàn)的MBLs 有IMP、VIM、SPM 和GIM 共4 種類型，耐藥基因由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)。耐藥方式產(chǎn)生形式多樣，例如耐藥酶的水平傳播。這是一種借助整合子的移動及基因盒的插入、切除方式實現(xiàn)的傳播方式。另外，由于基因環(huán)境的不斷變化，基因盒與整合子可以出現(xiàn)不斷進化，從而使得耐藥方式不斷更新。綜上所述，PA 的耐藥機制復(fù)雜，耐藥相關(guān)基因繁多，不同的藥物存在著不同的耐藥機制，同一類藥物亦可以是多種機制相互形成的結(jié)果。隨著認識及研究的不斷深入，新的耐藥機制有可能不斷被發(fā)現(xiàn)，對于PA 的耐藥相關(guān)基因的研究更待進一步探索。
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